摘要：梅尼埃病（Meniere disease，MD）是一种原因不明的、以膜路积水为主要病理特征的内耳病，临床表现为发作性眩晕、波动性听力下降、耳鸣和（或）耳闷胀感[1]。现阶段认为，MD的发病相关机制涵盖内淋巴吸收障碍与内淋巴管机械性阻塞、免疫反应等机制[1]，导

梅尼埃病（Meniere disease，MD）是一种原因不明的、以膜路积水为主要病理特征的内耳病，临床表现为发作性眩晕、波动性听力下降、耳鸣和（或）耳闷胀感[1]。现阶段认为，MD的发病相关机制涵盖内淋巴吸收障碍与内淋巴管机械性阻塞、免疫反应等机制[1]，导致膜迷路积水。目前现代医学治疗梅尼埃病的主要手段包括口服药物治疗、鼓室内注射治疗和外科手术治疗等[2]。口服倍他司汀等药物通常被作为MD早期治疗的方法，而鼓室内注射糖皮质激素或氨基糖苷类药物和外科手术被考虑作为口服药物治疗无效的后续治疗手段[3]，但这些措施存在治疗效率低的问题和具有潜在的听力损失风险，且患者对于手术的接受度较低[4-5]。与化学药治疗相比，中医药治疗在改善患者眩晕、耳闷、耳鸣、听力水平等方面展现出明显优势，远期疗效更佳，且不良反应少。相较于手术治疗对环境及设备等客观条件要求高等特点，中医药疗法创伤微小、容易开展的特点更具优势[6]。根据MD发作期眩晕明显的临床特点，中医将其归为“眩晕”“耳眩晕”的范畴[7]。其发病相关机制属于中医学人体水液代谢障碍的范畴，产生痰饮等病理产物[8]。因此，MD与“痰、饮、湿”密切相关[9]。朱丹溪提出“无痰不作眩”的理论，后世医家据此进行发挥，从痰饮、痰湿、痰浊、痰火、风痰、痰瘀治疗MD获得了良好疗效[10]。本研究通过数据挖掘探究基于“无痰不作眩”治疗MD的用药规律，并通过网络药理学和分子对接探究常用中药作用于MD的作用机制。

1 资料与方法

1.1 数据挖掘

1.1.1 文献来源与检索策略 通过检索中国知网（CNKI）、中国学术期刊数据库（万方）、中文期刊数据库（维普）和中国生物医学文献数据库（CBM）获得MD相关文献，检索时限设定为建库至2024年8月25日。以“梅尼埃”“美尼尔”“眩晕”“耳眩晕”；“中医”“中药”“中医药”；“痰”为检索词进行篇关摘检索，模糊匹配。将检索结果导入Note Express软件进行去重。

1.1.2 纳入标准与排除标准 纳入标准：（1）研究类型，中医药治疗MD临床研究、经验总结、病例报道等文献；（2）研究对象，西医诊断为MD的患者，中医诊断为眩晕；（3）干预措施，治疗方法明确提出独立使用中药处方治疗，且辨证用药是基于“无痰不作眩”理论。排除标准：（1）动物实验、系统评价、荟萃分析、综述、指南、会议论文、学位论文等；（2）无法获取全文和方剂组成等资料无法提取的文献；（3）无明确诊断（包括无明确中西医诊断、无明确证型诊断等）和用药理论不明确的文献；（4）疗效不明确的文献。

1.1.3 数据提取与数据规范 全文通读将文献中的处方进行整理录入，建立数据库，并由双人进行筛选校对、第3者进行审核处理。根据《中国药典》《中药学》和《中华本草》对收录的药物进行规范化处理，如“法半夏”“姜半夏”“清半夏”“制半夏”和“京半夏”规范为“半夏”，“川牛膝”“怀牛膝”规范为“牛膝”，“丹皮”规范为“牡丹皮”等。

1.1.4 数据分析 运用Microsoft Excel软件进行中药频次、药性、药味和归经分析。运用SPSS Modeler 18.0软件进行关联规则分析。使用SPSS Statistics 25.0软件进行聚类分析和因子分析。

1.2 网络药理学

1.2.1 核心药物活性成分与作用靶点筛选 使用中药系统药理学数据库（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database，TCMSP）（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索数据挖掘中得到的核心组方。将所含组方中药输入，以口服生物利用度≥30%，类药性≥0.18进行筛选治疗MD的核心药物活性成分及其靶点，利用Uniprot数据库（http:// UNIPROT.org/）标准化所筛选的作用靶点。

1.2.2 疾病靶点筛选 以“Meniere disease”为关键词通过CTD数据库（http://CTDBASE.org/）、OMIM数据库（http://OMIM.org/）和GeneCards数据库（http://GeneCards.org/）查询疾病基因。

1.2.3 药物-疾病交集靶点筛选及“药物-活性成分-交集靶点-疾病”网络构建 运用Veeny 2.1.0平台（https://www.bioinfogp.cnb.csic.es/TOOLs/ venny/）将有效成分的作用靶标与疾病靶标进行整合，得到交集靶点。进一步使用Cytoscape 3.7.0软件可视化处理中药、活性成分、交集靶点、疾病名称等数据，绘制“药物-活性成分-交集靶点-疾病”网络图。

1.2.4 蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction，PPI）构建及核心靶基因筛选 利用String数据库（https://www.STRING.org/），将交集靶点导入，设置“Multiple proteins”，物种选择“Homo sapiens”，选择相互作用评分（interaction score）为Highest confidence（0.900），并隐藏孤立蛋白，获取PPI，根据度（degree）值分析核心基因。

1.2.5 富集分析 通过DAVID信息网站（https://www.DAVID.ncifcrf.gov/）开展基因本体（gene ontology，GO）分析和基于京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集，从生物学过程（biological process，BP）、细胞成分（cellular components，CC）、分子功能（molecular function，MF）等多个层面对药物靶点进行功能验证，随后通过微生信数据平台（https://bioinformatics.com. cn/）对所获得的富集分析结果进行可视化，绘制富集气泡图。

1.3 分子对接

使用PDB数据库（http://www.rcsb.org/）下载关键靶点蛋白的晶体结构，使用PubChem数据库获取活性成分结构文件，使用AutoDockVina1.1.2软件进行分子对接分析，使用PyMol 2.3.0软件和DiscoveryStudio软件进行可视化处理。

1.4 实验验证

1.4.1 动物 SPF级雄性SD大鼠25只（成都达硕实验动物有限公司，许可证号SN0174487），体质量200～250 g，6～8月龄，常规饲养1周。纳入标准：无用药史、噪声暴露史，外耳道和耳膜均正常，耳廓反射灵敏，前庭功能正常（即无走步态不稳，头不断晃动，身体蜷曲，强迫环形运动等）。本实验已通过东莞市中医院医学伦理委员会批准[伦审（研）[2020]13号]。

1.4.2 药物及试剂 醋酸去氨加压素（deammonia vasopressin acetate，DDAVP，北京ChemicalBook公司，批号1021170303）、黄芩素（海源叶生物科技有限公司，质量分数≥98%，批号C06M11Y112461）、卡维丁（上海金穗生物有限公司，质量分数≥98%，批号J12840）、甲磺酸倍他司汀片（卫材药业有限公司，国药准字H20040130，产品批号2306057）。雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）抗体（批号ab108398）、细胞肿瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53，TP53）抗体（批号ab241566）、缺氧诱导因子1-α（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF1A）抗体（批号ab228649）、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）抗体（批号ab76238）、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）抗体（批号ab75991）、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP-responsive element binding protein，CREB）抗体（批号ab32515）、兔源磷酸甘油醛脱氢酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号ab313651），均购自英国Abcam公司。

1.4.3 MD模型大鼠造模 采用DDAVP注射法[11-12]造模，每天连续ip DDAVP 6 μg/kg，连续10 d。通过大鼠的行为学特征和蜗管横截面积与蜗管横截面积＋前庭阶横截面积的比值（＞1/3）来判断造模是否成功。其中，行为学特征改变包括：行走步态不稳、头不断晃动、身体蜷曲、强迫环形运动等。

1.4.4 实验分组及给药 实验分为5组，分别为正常组、模型组、黄芩素组、卡维丁组（根据分子对接结果，黄芩素和卡维丁对3个核心靶点的结合能结果最低，给药剂量通过文献研究结合前期预试验确定[13-14]）、倍他司汀组（根据成人剂量每人每天36 mg计算，换算成大鼠剂量为3.78 mg/kg）。具体操作见表1。取材时，大鼠注射4%多聚甲醛固定，快速断头，取出听泡，组织于−80 ℃保存。

1.4.5 qRT-PCR检测ESR1、TP53和HIF1A的mRNA表达 以GAPDH为内参，在PubMed网站设计引物（表2）。使用Tirzol法提取大鼠耳蜗组织总RNA，离心后取上层清液。沉淀清洗后，进行质量检测确定浓度。逆转录得到cDNA后，用2−ΔΔCt法计算ESR1、TP53和HIF1A基因的mRNA表达。

1.4.6 Western blotting法检测ESR1、TP53、HIF1A蛋白和cAMP信号通路相关蛋白表达水平 取适量新鲜耳蜗组织，加入RIPA裂解液，BCA法检测蛋白浓度。根据各样品蛋白浓度，以每孔40 μg蛋白总量上样。SDS-PAGE凝胶电泳后转膜、封闭，滴加一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，滴加二抗（1∶1 000）室温孵育2 h。滴加ECL显色，采集图像，通过Image J软件分析灰度值。

1.5 统计分析

使用SPSS 25.0软件处理数据，检验正态分布及方差齐性，计量资料采用描述，组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。当P＜0.05，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 用药规律分析

共检索到文献2 245篇，去重后根据纳入、排除标准筛选，共纳入文献121篇，包含处方130个，中药123味，中药总使用频次1 452次。

2.1.1 性味、归经频次分析 将123味中药进行频次统计后，根据频次由高到低排序，排名前10的中药分别是半夏、茯苓、白术、陈皮、泽泻、天麻、甘草、生姜、石菖蒲和钩藤（表3）。药性以温（24.39%）、平（23.58%）为主。药味以甘（28.86%）、苦（27.36%）、辛（26.37%）为主。主要归入肝经（20.00%）、脾经（15.15%）、肺经（14.85%）。

2.1.2 药物关联规则分析 使用Apriori算法对中药进行关联规则分析，设置最低支持度20%，最小置信度80%。增益＞1表示二者有很强的关联，增益为1表示二者没有关联，增益＜1表示二者为无效的强关联。将130个处方进行中药关联规则分析，共得到132条关联规则，进行可视化分析（图1），并分别根据支持度和置信度进行排序（表4）。结果发现陈皮→半夏、陈皮＋茯苓→半夏、陈皮＋白术→半夏和泽泻＋陈皮→半夏排名靠前，为最重要的药物组合。

2.1.3 中药聚类分析和因子分析 将频次＞30的11味中药进行聚类分析，设置距离类型为欧氏距离，聚类方法为最长距离法。得到治疗MD的药物主要有3类：第1类包含半夏、茯苓、白术、陈皮、泽泻；第2类为天麻、甘草、生姜；第3类为石菖蒲、竹茹、钩藤。见图2～4。

2.1.4 核心方筛选 根据数据挖掘结果，选定半夏、茯苓、白术、泽泻、陈皮为核心中药组合。以上5味味药物出现频率高，关联性强，且符合从“痰”论治。将以上药物组方，简称核心方。

2.2 网络药理学结果

2.2.1 中药活性成分及靶点筛选 根据筛选条件，共筛选出活性成分49个，其中半夏13个、茯苓15个、白术7个、泽泻10个和陈皮5个，包含1个共同的活性成分为谷甾醇（泽泻与陈皮共有）。经过整理，获取活性成分作用靶点98个。

2.2.2 疾病靶点筛选 获取疾病靶点GeneCards数据库141个、OMIM数据库545个、CTD数据库7 793个，整合去重后共8 342个。

2.2.3 交集靶点筛选 将活性成分作用靶点和疾病靶点取交集，得到交集靶点61个（图5）。

2.2.4 PPI网络构建及分析 根据筛选条件，将61个交集靶点导入，得到PPI网络（图6），根据degree值从大到小排列，发现位于前5的靶点是ESR1、TP53、HIF1A、Fos原癌基因（Fos proto-oncogene，FOS）和RELA原癌基因（RELA proto-oncogene，RELA）。

2.2.5 GO和KEGG富集分析 经过GO和KEGG分析并根据校正P值和count值进行排序取前10绘制气泡图。GO分析共得到BP：303个，主要富集在对异种刺激的反应、对信号转导的调控和对细胞转录、增殖和凋亡的调控；CC：53个，主要富集在细胞核的核质、染色质，细胞质的大分子复合体、线粒体、外泌体等功能位置；MF：91个，主要富集在与蛋白质、酶、锌离子的结合和转录因子、RNA聚合酶II转录因子、RNA聚合酶II核心启动子等与DNA的特异性结合（图7）。KEGG通路富集分析得到129条通路，核心方作用于MD的通路众多，包括癌症中通路、脂质与动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、乙型肝炎、人类免疫缺陷病毒1型感染等，主要富集在cAMP、磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）等信号通路（图8）。

2.2.6 “中药-活性成分-靶点-疾病”网络构建 将5种药物、31种活性成分（已排除无对应作用靶点的活性成分）、61个交集靶点和疾病导入，并进行美化得到“中药-活性成分-靶点-疾病”网络图（图9），该网络包含121个节点和422条边。将数据导出分析，根据degree值进行从大到小排序，发现排名靠前的药物活性成分有黄芩素、β-谷甾醇、卡维丁等（表5），涉及核心方中5种中药，但以半夏最多、最重要。

2.3 分子对接结果

选取PPI网络中排名前3的靶点（ESR1、TP53、HIF1A）和“中药-活性成分-靶点-疾病”网络中排名前3的活性成分（黄芩素、β-谷甾醇、卡维丁）进行分子对接验证。使用PDB数据库下载靶点蛋白，编号分别为6CBZ、6VR1和1H2K，使用PubChem数据库下载活性成分，PubChem CID分别为5281605、222284、193148。各靶点与成分的结合能均小于−5 kcal/mol（1 kcal＝4.3 kJ）如表6所示。说明各靶点与成分结合良好，其中结合能较低的有HIF1A与β-谷甾醇、HIF1A与卡维丁、HIF1A与黄芩素、TP53与黄芩素等。选取结合能最低的4个组合进行可视化处理，得到2D与3D图像（图10）。

2.4 核心成分对大鼠耳蜗组织ESR1、TP53和HIF1A的mRNA表达的影响

与正常组相比，模型组大鼠耳蜗组织中ESR1、TP53和HIF1A的mRNA表达量明显上调（P＜0.01）。与模型组相比，黄芩素组、卡维丁组和倍他司汀组大鼠组织中ESR1的mRNA表达量明显下调（P＜0.05、0.01）。与模型组相比，黄芩素组、卡维丁组和倍他司汀组大鼠组织中TP53的mRNA表达量明显下调（PHIF1A的mRNA表达量明显下调（P＜0.01、0.05）。见图11。

2.5 核心成分对大鼠耳蜗组织ESR1、TP53和HIF1A的蛋白表达的影响

与正常组相比，模型组大鼠耳蜗组织中ESR1、TP53和HIF1A蛋白表达明显上调（P＜0.05、0.01）。与模型组相比，黄芩素组、卡维丁组和倍他司汀组大鼠耳蜗组织中ESR1、TP53和HIF1A蛋白表达明显下调（P＜0.05），见表7和图12。

2.6 核心成分对大鼠耳蜗cAMP信号通路相关蛋白表达的影响

结果如图13和表8所示，与对照组比较，模型组大鼠耳蜗组织中cAMP、PKA和CREB蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芩素组、卡维丁组和倍他司汀组大鼠耳蜗组织中cAMP和PKA蛋白表达明显下调（P＜0.05），而对CREB蛋白影响不明显。

3 讨论

MD属于中医“耳眩晕”病，是因耳窍病变引起的以头晕目眩、如坐舟车、天旋地转为主要临床特点的耳病，对应中医古籍中“眩冒”“风眩”“真眩晕”等论述[15]。根据病因和临床表现不同，常将其分为风邪外袭、肝风内动、痰浊中阻、阳虚水泛、肾精亏虚、脾气虚弱等证型。从病因上来说，MD的发病不离“风”“火”“痰”“虚”“瘀”等因素，常相兼为患。除了免疫反应学说、内耳缺血学说等发病机制，内淋巴管机械性阻塞与内淋巴吸收障碍导致膜迷路积水，属于水液代谢障碍范畴，即产生了痰饮等病理产物，随着三因变化或与其他邪气相兼，又可演变出寒痰、痰浊、风痰、痰火、痰瘀等[16]。研究显示，MD患者中辨证为痰湿中阻、痰浊中阻、痰湿夹瘀等证型的病例最多[17]。因此，从痰治疗MD尤为重要，朱丹溪提出“无痰不作眩”，刘河间提出从“痰火”治眩，皆为要法。

基于MD的特点，本研究从痰论治MD的用药规律。结果显示，常用药物包括半夏、茯苓、白术、泽泻、甘草、陈皮、天麻、生姜、石菖蒲、钩藤等，用药总体以健脾燥湿化痰和息风豁痰开窍为主。从组方分析，上述药物主要包含小半夏汤、半夏白术天麻汤、泽泻汤、二陈汤等经典方剂，小半夏汤化饮止呕，为“治呕祖方”；半夏白术天麻汤息风化痰、健脾祛湿；泽泻汤健脾化饮、降逆止眩；二陈汤燥湿化痰、理气和中，以上各方涉及祛湿化痰、止呕定眩之功，符合MD的治法。从归经分析，以肝、脾、肺经为主，“脾为生痰之源，肺为贮痰之器”，脾为至阴之脏，通于长夏之气，易受长夏湿邪所扰，“诸湿肿满，皆属于脾”，而脾的生理功能为运化水液，肺的生理功能为通调水道，运化通调失常则会导致水液停聚，从而变生湿、饮、痰等诸多病理产物。“诸风掉眩，皆属于肝”，肝主风，风火皆可致眩，而风为百病之长，易夹其他邪气治病，如风痰之类，在临床上也有用“风药”治疗MD[18]。从药性分析，以性平、温为主，《金匮要略》提出治疗痰饮病当以温药和之，“痰为阴邪，非温不化”，温药可以振奋阳气、通调水道，既可以杜绝生痰之源，又可以疏通驱邪之道，而“和之”是指用药不可过于温燥或温补，因此常用性平之药，驱邪而不伤正。从药味分析，以甘、苦、辛为主，辛能发散，苦能燥湿，二者辛开苦降以治标实。《金匮要略》指出：“肝之病，补用酸，助用焦苦，益用甘味之药调之”，李杲指出“补脾必用甘味”，甘能补虚，而痰饮之生成常因肺脾肾不足，因此治以甘味能补不足以治本。从关联规则分析来看，半夏→茯苓、半夏→白术、陈皮→半夏、陈皮＋茯苓→半夏排名靠前，为最重要的药物组合，而聚类分析得到2类重要的药物，综合来看，最重要的核心药物组合为半夏、茯苓、白术、泽泻、陈皮。

将核心方进行网络药理学分析，结果显示，在“中药-成分-靶点-疾病”网络图中，重要的活性成分包括黄芩素、β-谷甾醇、卡维丁等。黄芩素是一种具有多种生物活性功能的黄酮类化合物，包括抗氧化应激、抗炎症反应、神经保护作用等[19]。β-谷甾醇是一种植物类固醇，属于四环三萜类化合物，具有调节血脂、抗氧化、减少炎症反应、免疫调节和镇痛等多种生物活性[20-21]。卡维丁是一种异喹啉类生物碱，属于季铵碱类化合物，对于炎症反应、氧化应激及病毒感染等具有明显的抑制作用[22-23]。研究发现，MD患者中伴有自身免疫性疾病的患者人数更多，且眩晕的时间和耳鸣症状的出现也与免疫因素相关，而MD患者内耳淋巴液分析也可以发现抗原-抗体复合物和γ-干扰素等炎症因子[24]。各种炎症疾病或病毒感染引起的变态反应损伤和炎症损伤是导致MD的重要因素[25]。本研究发现的活性成分多具有免疫调节与抗炎症反应的作用，可以作为潜在治疗药物进一步开发与探索。PPI网络分析表明，核心的靶点包括ESR1、TP53、HIF1A等，KEGG富集分析发现，核心的通路包括cAMP、雌激素、PI3K-Akt等信号通路。ESR1为雌激素受体（estrogen receptor，ER）基因，是雌激素信号通路中的重要靶点之一。雌激素与核内ER结合，诱导靶基因表达并刺激ER信号传导[26]。当前研究表明，ESR1与肝细胞癌[27]、终末期肾病[28]、乳腺癌等疾病有关，ESR1突变引起雌激素受体活性的变化，导致激素治疗耐药性的产生[29]。目前暂未有ESR1与MD的相关报道，其作用机制还有待探索。TP53是cAMP信号通路中的关键基因之一， TP53是重要的抑癌基因，对预防肿瘤至关重要，可以调节与细胞凋亡、代谢、DNA修复和细胞周期停滞相关基因的表达[30]。MD的眩晕症状的分子机制研究表明，cAMP内耳液稳态中充当着重要信使[31-32]。多项动物实验发现，电针和泽泻汤均可以改善膜迷路积水来治疗MD，且使血浆中cAMP含量降低[33-35]。因此，中医药介导cAMP信号通路在MD的治疗中有着广阔的发展前景。是引起缺氧激活反应的重要因子，可以在不同缺氧条件下激活TP53的作用[36]。PI3K/Akt信号通路作为一种经典信号传导途径，与氧化应激、免疫反应、炎症反应及细胞增殖凋亡等因素有关[37]。研究表明，核转录因子-κB是PI3K/Akt信号通路下游重要的靶点，被激活后可以诱导其他基因表达而产生大量的炎症因子，诱导炎症反应加重[38]。而炎症反应也参与MD的发病，因此通过PI3K/Akt信号通路抑制炎症反应而缓解MD的症状也是治疗的潜在靶点。

本研究进行了大鼠实验验证，结果表明黄芩素、卡维丁可以明显降低MD大鼠耳蜗组织中ESR1、TP53、HIF1A基因的mRNA和蛋白的表达，以及明显下调关键通路中cAMP和PKA蛋白表达。

综上，本研究通过检索基于“无痰不作眩”理论治疗MD的相关文献，发现现代医家多从痰饮、痰湿、痰浊、风痰、痰火、痰瘀等角度进行辨证施治，常用半夏、茯苓、白术、泽泻、陈皮等药物，进一步使用网络药理学方法，发现以上药物主要通过黄芩素、β-谷甾醇、卡维丁等活性成分作用于ESR1、TP53、HIF1A等靶点和cAMP、雌激素、PI3K-Akt等信号通路，可能发挥其抗炎、抑制免疫反应和调节内耳水液循环作用来防治MD。

来 源：王胜男，孔智谦，周智慧，何念财，黄海燕．基于数据挖掘、网络药理和分子对接分析中药组方治疗梅尼埃病的作用机制 [J]. 中草药, 2025, 56(6): 2066-2078.

来源：天津中草药