摘要：SPY555-DNA是一种基于我们SPY™染料系列的明亮且无毒的活细胞核染料。其优化的结构能够快速标记活细胞和固定细胞中的DNA，具有高特异性和极低的背景信号。SPY555-DNA可以在不需要遗传操作或荧光蛋白过表达的情况下，对活细胞或固定细胞的细胞核进行染色
SPY555-DNA是一种基于我们SPY™染料系列的明亮且无毒的活细胞核染料。其优化的结构能够快速标记活细胞和固定细胞中的DNA，具有高特异性和极低的背景信号。SPY555-DNA可以在不需要遗传操作或荧光蛋白过表达的情况下，对活细胞或固定细胞的细胞核进行染色。其吸收和发射特性与四甲基罗丹明（TMR）相似。SPY555-DNA能够与SPY505、SPY595、SPY650、SPY700、SiR和GFP进行多色成像。SPY555-DNA可以使用标准的TMR或Cy3滤光片组进行成像。它适用于活细胞或固定细胞和组织的宽场、共聚焦、SIM或STED成像。包含1瓶SPY555-DNA（冻干）。
艾美捷SPY555-DNA探针（#CY-SC201）：
吸收峰（λabs）：555 nm
荧光峰（λfl）：580 nm
是否适用于固定细胞：是，适用于PFA和甲醇固定的细胞
探针数量：100次染色
荧光寿命：2.4 ns
STED耗竭波长：660或775 nm
运输条件：室温
储存与操作：
收到后将探针储存于-20°C或更低温度。冻干探针在室温下可稳定保存超过1周，在-20°C下可稳定保存超过12个月。使用无水DMSO复溶SPY555-DNA。我们建议使用新开封的无水DMSO来制备1000倍浓缩液。DMSO在接触空气和水分时会产生降解产物，这些产物即使在-20°C下也会显著缩短溶液中探针的保质期。使用后，将1000倍浓缩液保存在-20°C或更低温度。在打开前，应将小瓶恢复至室温。如果储存得当，1000倍浓缩液可稳定保存3个月。注意：DMSO溶液应特别小心处理，因为DMSO已知会促进有机分子进入组织。请按照所有相关的当地规定处理这些试剂。
标记协议：
注意：本协议是使用贴壁于盖玻片的HeLa细胞优化的，并已在其他常见细胞系中得到验证。本协议中的建议应作为起点，每种细胞类型的最优标记条件应通过实验确定。SPY555-DNA基于DNA小沟结合分子双苯并咪唑。在高剂量下，它可能会改变活细胞中的DNA代谢。因此，如果计划进行长期（>12小时）成像实验，建议使用1000倍或更高稀释度的SPY555-DNA进行染色。对于其他所有用途，建议使用1000倍稀释度的SPY555-DNA进行染色。
制备1000倍浓缩液：向SPY555-DNA小瓶中加入50 µL无水DMSO，制备1000倍浓缩液。我们建议使用新开封的无水DMSO来制备1000倍浓缩液。DMSO在接触空气和水分时会产生降解产物，这些产物即使在-20°C下也会显著缩短溶液中探针的保质期。此时，溶液可能有颜色，但这不会影响探针的性能。使用后，应将该溶液保存在-20°C或更低温度。不要将1000倍浓缩液分装成小份，因为它们会更快降解，且探针不会因多次冻融循环而改变。如果储存得当，该浓缩液可稳定保存3个月。
制备染色液：在常用的细胞培养基（例如DMEM + 10%胎牛血清）中将SPY555-DNA稀释至1倍浓度，并短暂涡旋。如果稀释不是一步完成，请使用DMSO制备中间稀释液，因为使用水性缓冲液制备中间稀释液会导致探针聚集。快速进行下一步。由于染色效率可能因细胞系而异，建议首次尝试时使用1000倍稀释度进行染色，然后在后续实验中优化SPY555-DNA的稀释倍数，直至获得最佳染色效果（参见下表中的标记浓度和孵育时间）。仅使用新制备的染色液，不要多次使用。
细胞准备和染色：按照常规方法在盖玻片、玻璃底培养皿或玻璃底多孔板上培养细胞。当细胞达到所需密度时，用步骤2新制备的染色液替换培养基，确保所有细胞都被溶液覆盖。将细胞置于37°C、含5% CO₂的湿润环境中孵育，并根据确定标记时间作为探针浓度的函数。
注意：SPY555-DNA可以染色用甲醛（PFA）和甲醇固定的细胞中的DNA。
细胞成像：使用标准TMR或Cy3设置对SPY555-DNA进行成像效果最佳。标记后，活细胞可以立即成像，无需洗涤步骤。可选地，用不含探针的新鲜培养基替换一次标记液通常可以提高信噪比。如果进行时间序列成像，建议在整个实验过程中保持成像介质中含有探针，以获得稳定的信号。如果在成像前对细胞进行了洗涤，染色效果将持续数小时。请注意，SPY555-DNA可能会被360-390 nm的光激发，并由于探针的DNA结合部分的荧光而在约450 nm处产生一些荧光。
*基于以下条件：每次染色实验使用0.5 ml染色溶液，探针浓度为1倍。通过减少体积或探针浓度，可以进一步增加染色实验的次数。
**标记时间是针对HeLa细胞确定的，可能会因使用的细胞系而有所不同。
来源：科学大课堂