摘要：人类大脑皮层由六层细胞构筑与数十个功能各异的区域共同构成，其发育异常已被证实与自闭症、癫痫、智力障碍等多种神经精神疾病密切相关。传统单细胞转录组技术虽能精准识别细胞类型，却在细胞解离过程中丢失了关键的空间信息，使我们难以捕捉皮层分层与区域特化的时空动态。

人类大脑皮层由六层细胞构筑与数十个功能各异的区域共同构成，其发育异常已被证实与自闭症、癫痫、智力障碍等多种神经精神疾病密切相关。传统单细胞转录组技术虽能精准识别细胞类型，却在细胞解离过程中丢失了关键的空间信息，使我们难以捕捉皮层分层与区域特化的时空动态。

2025 年 8 月 7 日，《Nature》刊发了哈佛医学院团队的研究长文《Spatial transcriptomics reveals human cortical layer and area specification》。作者利用 MERFISH 和空间转录组技术，辅以深度学习细胞分割和跨平台数据验证，首次绘制了人类胎儿大脑皮层的单细胞级空间图谱，系统阐明了皮层分层与区域特化的分子机制。

MERFISH：10例人类胎儿大脑样本（孕周GW15–GW34），覆盖8个皮层区域，共分析约1800万个细胞；

snRNA-seq：对连续切片进行单核RNA测序，共91,898个细胞；

10x Visium：对相邻切片进行空间全转录组分析；

免疫组化/RNAscope：用于验证基因表达和蛋白定位；

跨物种样本：包括小鼠、雪貂和猕猴胎儿脑组织，用于比较分析。

1. 人类胎儿大脑皮层的空间单细胞图谱构建

本部分构建了人类胎儿皮质的空间转录组图谱，涵盖 10 个个体、7 个发育时间点（GW15 至 GW34）的 8 个皮质区域，共分析约 1800 万个单细胞。采用 MERFISH 技术，结合自定义深度学习模型（基于 CellPose 2.0）实现细胞核分割，确保单细胞分辨率，并通过 snRNA-seq 和 10x Visium 验证。

细胞聚类分为三级层次（H1-H3）：H1 识别出 8 类细胞（放射状胶质细胞 RG、中间祖细胞 IPCs、迁移兴奋性神经元 EN-Mig 等）；H2 将其细分为 33 种细胞类型；H3 进一步分为 114 种亚型（含 58 种兴奋性神经元亚型）。空间分布显示，H2 细胞类型清晰勾勒出 VZ、iSVZ、oSVZ、IZ、SP、CP、MZ 等层状结构，且不同 gestational age 和区域的细胞类型组成具有高度可重复性。此外，GW20-GW22 的背侧前脑 VZ 中发现大量抑制性神经元（INs），其数量超过 RG 和 IPCs，提示可能存在背侧起源的 INs。

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图 1 注：a. 样本采集和分析流程示意图，包括 MERFISH、snRNA-seq 和 Visium 整合。b-c. UMAP 图显示 H1 细胞类别（b）和 H2 细胞类型（c）的聚类结果。d. 主要皮质区域在 GW15-GW34 期间 H2 细胞类型的空间分布（比例尺 500μm）。e. 点图显示 H2 细胞类型的顶级标记基因表达。f. 热图显示 MERFISH 的 H2 簇与已发表 scRNA-seq 数据集的对应关系。

2. 皮层分层的渐进式形成

研究发现，人类皮质层的分子特化早于形态学分化。GW15 时可见 4-6 层，GW20 时可见 3-6 层，GW22 时通过兴奋性神经元（EN）亚型的层状分布可清晰识别 6 层结构，而 cytoarchitectural 差异直至 GW34 才出现，符合 “由内而外” 的形成序列。层定义性 EN 亚型（如 EN-IT-L4-1、EN-ET-L5-1）的皮质深度（CD）分布稳定，且随时间逐渐细化。与 EN-ETs 相比，EN-IT 亚型常跨多层分布，呈钟形曲线，导致层间混合。抑制性神经元（INs）在 GW15-GW22 无层特异性，GW34 时生长抑素（SST）INs 开始富集于 2-3 层，与成体模式一致。

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图 2 注：a. 左：GW34 前额叶皮质（PFC）中，层定义性 EN 亚型的空间分布勾勒出 L2-L6；右：脊线图显示这些亚型的 CD 分布（虚线为层边界）。b. 脊线图显示 GW34 PFC 中 EN-ETs、深层 EN-ITs 和上层 EN-ITs 的空间复杂性。c. 空间图和脊线图显示 GW15-GW22 皮质层的渐进形成，GW22 时分子层面已出现 6 层结构（无形态差异）。d-f. GW22 时 PFC 和 V2 中 EN-ETs（d）、深层 EN-ITs（e）、上层 EN-ITs（f）的空间分布和 CD 分布（层定位一致，数量存在区域差异）。g. 小提琴图显示 GW22 和 GW34 PFC 中 IN 亚型的层分布，箭头示 GW34 时 SST INs 富集于 2-3 层（比例尺 500μm）。

3. 基因表达的时空动态性

经典成体皮质层标记基因在胎儿期的层特异性较弱，故筛选出妊娠中期层特异性基因（如 CBLN2、CYP26A1）。这些基因的表达具有时空动态：CBLN2 在 GW22-GW34 的额叶 2-3 层富集，且 6 层低表达贯穿全期；CYP26A1 在额叶 2-3 层特异性表达，同时在全区域 6 层和 SP 的 EN-ETs 中高表达。

区域特化方面，沿前后轴（AP）存在连续梯度模式：7 个 EN-ET 亚型和 15 个 EN-IT 亚型分别在前后部逐渐富集，形成梯度分布。差异表达基因（DEGs）分析显示，CBLN2、CPNE8 等基因在多个层中均表现为前部富集，而 NPY、RORB 等为后部富集。这些基因在迁移后 ENs 中富集，提示区域身份在迁移中或之后形成。

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图 3 注：a. 表格比较成体 PFC 与妊娠中期 PFC 的经典层标记基因表达模式（保守模式加粗）。b. 小提琴图显示 GW22 PFC 和 V2 中层依赖性基因的 CD 表达（虚线框示区域特异性差异）。c-d. CBLN2 的 z 分数空间图（c）和时空表达热图（d），显示其额叶 2-3 层富集及 6 层持续低表达。e. 热图和 z 分数图显示 PFC 中 2-3 层富集基因的表达动态（箭头示上调 / 下调方向）。f. 示意图总结 GW22 时用于近似不同区域皮质层的 5 种标记基因组合。g. GW22 时前后富集 EN 亚型的空间分布和丰度曲线。h. 点图显示 GW20 和 GW22 迁移后 ENs 中区域富集基因的表达。

4. 神经元亚型的区域梯度特化

GW20 时，初级视觉皮质（V1）和次级视觉皮质（V2）在形态上无差异，但 MERFISH 显示二者存在由 4 对 EN 亚型定义的清晰分子边界，且在 3-4 层过渡最 abrupt。V2 富集亚型广泛分布于其他区域，而 V1 特异性亚型仅存在于 V1。

该边界由基因表达的二元切换驱动，如 NPY 在 V1 的 3-4 层强烈富集，且仅在 GW20-GW21 出现。Visium 全转录组分析验证了该边界，显示其贯穿所有皮质层和 SP，但 IZ、oSVZ 等区域均一。与小鼠、雪貂不同，猕猴（E76、E93）的 V1-V2 也存在 NPY 标记的边界，提示灵长类保守性。

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图 4 注：a. GW20-GW21 时 V1 和 V2 无形态差异（Nissl 染色、DAPI 和 H&E 染色，比例尺 500μm）。b-c. GW20 枕叶皮质的空间图显示，EN 亚型的急剧过渡标记 V1-V2 边界（比例尺 500μm）。d. 脊线图显示 V1/V2 富集 EN 亚型在 CP 边界附近的水平密度分布。e. 脊线图显示 V1/V2 富集亚型的层分布（共享相同层定位）。f. 直方图显示 V2 富集亚型广泛分布，而 V1 富集亚型仅存在于 V1。g. V1/V2 富集基因的 z 分数空间图（如 NPY 在 V1 3-4 层富集）。h-i. Visium 分析显示边界处额外差异基因（h）及全层边界（i）。j. Visium 点的 UMAP 显示 V1 和 V2 轨迹在 SP 处分支。

5. V1–V2边界机制与跨物种保守性

V1 特异性神经元的分子特征随时间动态变化：GW20 时 NPY、IGFBPL1 在 V1 富集，GW34 时减弱，成年期消失；而 TRPM3、CUX1 在 GW34 和成年期持续富集。EN-ITs 的 V1 富集基因具有瞬时性，EN-ETs 的则更稳定（如 TSHZ3、GABRA5）。整合 snRNA-seq 与 MERFISH 发现，V1 特异性 4 层神经元中突触发生相关基因（如 NRXN-NLGN 通路）早期上调，突触素免疫染色显示 GW20 时 V1 的突触 puncta 密度高于 V2。此外，人类 V1 中 CDH13 下调和 TRPC6 上调的模式与小鼠出生后关键期相似，提示丘脑传入可能在 GW26（胎儿睁眼期）参与 V1 特化。

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图 5 注：a. GW34 时 V1 和 V2 的 EN 亚型空间分布（比例尺 500μm）。b. 直方图显示 GW34 时 V1 富集亚型仅存在于 V1（BA17）。c. 成年期 V1 和 V2 的 EN 亚型差异。d. 热图显示 EN-ITs 的 V1 富集基因集在不同时期的动态（早期：GW15，中期：GW20，晚期：GW34）。e. NPY 和 IGFBPL1 在 GW20 V1 中特异性富集。f-g. 热图显示 EN-ETs 的 V1 富集基因（f）和 V2 富集基因（g）更稳定。h. GO 分析显示 V1 特异性 4 层神经元中突触组装和细胞粘附相关通路上调。i. 热图显示 NRXN 信号在 V1 特异性 4 层神经元中富集。j. 网络热图显示 V1-IT-L4 神经元同时接收 IN 和 EN 的 NRXN 信号。k. 免疫染色验证 GW20 时 V1 的突触素 puncta 密度高于 V2（***P=0.00037，比例尺 500μm 及 100μm）。

本研究通过高分辨率空间转录组技术，首次在单细胞水平上揭示了人类大脑皮层分层和区域特化的时空动态，提出了“连续梯度”与“离散边界”并存的发育模型，并强调了丘脑输入在 prenatal 阶段对V1区特化的重要作用。该研究为理解大脑皮层发育及相关疾病提供了宝贵的资源和新的视角。

迈维代谢作为覆盖单细胞与空间多组学全链条解决方案的知名企业，全面覆盖【单细胞转录组-单细胞蛋白组-单细胞代谢组】、【空间转录组-空间蛋白组-空间代谢组】六大领域，构建了从单细胞到空间维度的完整技术生态。通过精准的多组学检测和个性化的分析服务，迈维代谢不仅为科学研究提供了全方位的技术支持，更致力于推动临床转化，助力健康管理和疾病治疗的创新发展。

来源：科学联线牵