摘要：模拟肿瘤微环境（TME）的胰腺导管腺癌（PDAC）类器官是识别TME如何影响PDAC恶性肿瘤的有效工具。日本东京大学Hideki Taniguchi团队提出了一种使用患者来源的PDAC细胞和人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的内皮细胞和间充质细胞产生融合的胰腺

模拟肿瘤微环境（TME）的胰腺导管腺癌（PDAC）类器官是识别TME如何影响PDAC恶性肿瘤的有效工具。日本东京大学Hideki Taniguchi团队提出了一种使用患者来源的PDAC细胞和人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的内皮细胞和间充质细胞产生融合的胰腺癌类器官（FPCO）的方案，该方案部分复制TME，包括异质性癌症相关成纤维细胞（CAF）。文章还描述了分析FPCO特性的过程。FPCO可以为建立可靠的药物筛选系统提供平台。

文章介绍

题目：Protocol for generating a pancreatic cancer organoid associated with heterogeneous tumor microenvironment

期刊：STAR Protocols

影响因子：1.3

发表日期：2025年1月

#1

研究背景

Background

既往研究已经使用类器官技术生成了用于基础和应用研究的体外PDAC模型。由于TME和肿瘤恶性之间的强关联，最近将基质细胞（包括CAF）与PDAC类器官共培养。然而，原代基质细胞具有有限的增殖能力和产生体内肿瘤组织中检测到的不同类型细胞的能力。为了在PDAC TME中复制基质细胞的复杂性，研究人员将PDAC细胞与hiPSC衍生的间充质细胞和内皮细胞共培养。生成的类器官称为FPCO，模拟PDAC细胞导管结构，并与含有异质CAF，肿瘤内皮细胞和丰富的细胞外基质蛋白的TME相关。该研究详细介绍了FPCO的产生，耐药性测定和CAF异质性的评估协议。

#2

研究思路

Research Thinking

1. 建立类器官

2. hiPSC诱导分化为间充质细胞（MC）和内皮细胞（EC）

3. FPCO的产生

4. FPCO的分析

#3

研究设计

Research design

工作流程包括胰腺癌类器官的建立（步骤1-25）、hiPSC诱导分化为内皮细胞（步骤26-38）、hiPSC诱导分化为间充质细胞（步骤39-45）、增殖性FPCO的产生（步骤46-64）、静态FPCO的产生（步骤65-67）、FPCO的化疗耐药试验（步骤68-80）、FPCO的再增殖测定（步骤81-88）、FPCO的石蜡包埋（步骤89-101）、FPCO的组织学分析（步骤102-114）、FPCO的免疫荧光染色（步骤115-131）。

预期结果

PDAC细胞的管腔结构在FPCO中形成，FPCO在间隙中含有大量ECM并含有多种CAF。与PDAC TME相连的FPCO可以在不使用外源ECM的情况下产生（如基质胶）。此外，通过改变培养条件，可以诱导FPCO类似于PDAC组织的两个方面：pFPCO在抗癌药物治疗后表现出再增殖的潜力，而qFPCO表现出比PCO（PDAC细胞的单培养物）更强的化学抗性。与TME相关的FPCO，特别是qFPCO有望成为一种可靠的筛选抗癌候选药物的系统。

FPCO含有iCAF、myCAF和apCAF样细胞，这些细胞是从来源于hiPSC的未成熟间充质细胞分化而来的。因此，可以详细监测CAF的分化过程和每种亚型影响PDAC细胞增殖和/或转移特性的方式。此外，通过掺入额外的TME细胞，例如巨噬细胞和淋巴细胞，可以调节FPCO系统以复制PDAC组织的复杂性。

局限性

与简单的2D或球状体培养相比，FPCO系统需要实施几种技术，例如原代PDAC细胞培养、球状体培养和hiPSC维持和分化。由于患者PDAC组织大小的限制，可能难以建立源自某些患者组织的PDAC细胞。通过将球状体沉积到细胞培养插入物上来生成FPCO需要培训。使用本研究的方法建立胰腺癌类器官（步骤1-25），获得在5次传代后仍可以维持的PDO的产率约为60%，低于先前工作中报道的75%。使用重组WNT3A和RSPO1代替其条件培养基以及用于来自肿瘤组织的PDAC细胞的温和MACS解离剂可能会降低PDAC细胞扩增的效率。

准备工作（1天）

1. 胰腺癌类器官培养基成分

a.N-乙酰基-L-半胱氨酸（500 mM）。①取815.95 mg N-乙酰-L-半胱氨酸粉末，溶于10 mL ddH2O中。②用0.22 mm聚醚砜（PES）膜过滤溶液。保存在-20℃最多6个月。

b.烟酰胺（2 M）。①取12.212 g烟酰胺粉末，溶于50 mL ddH2O中。②用0.22 mm PES膜过滤溶液。保存在-20℃最多6个月。

c.人表皮生长因子（EGF）（2 μg/mL）。①hEGF储备液：将0.5 mg hEGF冻干粉溶解于25 mL含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）（-）中，并将100 μL等分试样置于1.5 mL试管中。将溶液保存在-20℃最多6个月。②使用前，用0.1% BSA的PBS溶液（-）将储备液稀释10倍。

d.人Noggin（0.1 mg/mL）。①hNoggin储备液：将1 mg hNoggin冻干粉溶解于1 mL含0.1% BSA的PBS（-）中，并将100 μL等分试样置于1.5 mL试管中。将溶液保存在-20℃最多6个月。②使用前，使用0.1% BSA的PBS溶液（-）将贮备液稀释10倍。

e.A83-01（1 mM）的浓度。①A83-01贮备液：取10 mg A83-01冻干粉，溶于948.9 μL DMSO中，取20 μL等分试样，置于1.5 mL试管中。将溶液保存在-20℃最多6个月。②使用前，用DMSO将储备液稀释25倍。

f.人成纤维细胞生长因子10（FGF 10）（0.1 mg/mL）。①hFGF 10储备液：将1 mg hFGF 10冻干粉溶解于1 mL 0.1% BSA PBS溶液（-）中，并将100 μL等分试样置于1.5 mL试管中。将溶液保存在-20℃最多6个月。②使用前，用0.1% BSA的PBS溶液（-）将储备液稀释10倍。

g.人胃泌素I（21 μg/mL）。①人胃泌素I贮备液：将1 mg 人胃泌素I冻干粉溶解于4.766 mL 0.1% BSA PBS溶液（-）中，并将100 μL等分试样置于1.5 mL试管中。将溶液保存在-20℃最多6个月。②使用前，用0.1% BSA的PBS溶液（-）将储备液稀释10倍。

H.人Wnt-3a（50 μg/mL）。人Wnt-3a贮备液：将500 μg 人Wnt-3a冻干粉溶解于10 mL 0.1% BSA的PBS溶液（-）中，并将500 μL等分试样置于1.5 mL试管中。将溶液保存在-20℃最多6个月。

I.人R-Spondin-1（0.1 mg/mL）。①人R-Spondin-1贮备液：将1 mg 人R-Spondin-1冻干粉溶解于1 mL 0.1%BSA的PBS溶液中（-），并将100 μL等分试样置于1.5 mL试管中。将溶液保存在-20℃最多6个月。②使用前，用0.1% BSA的PBS溶液（-）将储备液稀释10倍。

2. hiPSC-内皮和间充质细胞分化培养基的组分

a.CHIR99021（2 mM）。①CHIR 99021贮备液：取10 mg CHIR 99021粉末，溶于2.15 mL DMSO中，取200 μL等分试样，置于1.5 mL试管中。将溶液保存在-20℃最多6个月。②使用前，用DMSO将贮备液稀释5倍。

b.人骨形态发生蛋白4（BMP 4）（10 mg/mL）。人BMP 4储备液：将250 μg hBMP 4冻干粉溶解于2.5 mL含0.1% BSA的PBS（-）、5 mM Tris-HCl和500 μL等分试样中，置于1.5 mL试管中。将溶液保存在-20℃最多6个月。

c.人血小板衍生生长因子BB（PDGF-BB）（10 μg/mL）。人PDGF-BB储备液：将10 mg hPDGF-BB冻干粉溶解于1 mL含0.1% BSA的PBS（-）中，并将200 μL等分试样置于1.5 mL试管中。将溶液保存在-20℃最多6个月。

d.人激活素A（33.3 μg/mL）。人激活素A储备液：解冻100 μg/mL 人激活素A溶液，然后用0.1% BSA的PBS溶液（-）稀释3倍。取500 μL，置于1.5 mL试管中，将溶液保存在-20℃最多6个月。

e.人基础FGF（5 μg/mL）。①人基础FGF储备液：将100 μg 人基础FGF冻干粉溶解于1 mL含0.1% BSA的PBS（-）、5 mM Tris-HCl和50 μL等分试样中，置于1.5 mL试管中。将溶液保存在-20℃最多6个月。②使用前，用含0.1% BSA的PBS（-）和5 mM Tris-HCl将贮备液稀释20倍。

f.人血管内皮生长因子（VEGF）（100 μg/mL）人VEGF储备液：将1 mg hVEGF冻干粉溶解于10 mL含0.1% BSA的PBS（-）中，并将500 μL等分试样置于1.5 mL试管中。将溶液保存在-20℃最多6个月。

G.毛喉素（2 mM）。毛喉素贮备液：取10 mg毛喉素粉末，溶于12.18 mL DMSO和500 μL等分试样（1.5 mL试管）中。将溶液保存在-20℃最多6个月。

3. 解冻减生长因子的Matrigel

将减生长因子的Matrigel在4℃下解冻16小时。注：使用Matrigel生长因子2周内减少。参考生产信息，解冻后的Matrigel可分装并储存在-20℃。但对该方案的适应性还未验证。

4. 胰蛋白酶-EDTA反应终止培养基。

a.将50 mL灭活FBS和5 mL青霉素-链霉素混合物加入500 mL Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），高葡萄糖。

5. 制备含有表达荧光素酶或secNanoluc的慢病毒的上清

a.根据先前报告的方案，使用氯化钙法在55 cm2培养皿中将SIN载体质粒（CSII-EF-Luc-IRES 2-EGFP或CSII-EF-SecNanoluc-IRES 2-hKuO 1）、包装质粒（pCAG-HIVgp）和VSV-G，Rev质粒（pCMV-VSV-G-RSV-Rev）诱导至293T细胞。

b.在37 ℃，5%CO2条件下培养293T细胞24小时。

c.用7.5 mL DMEM（10%FBS、1%P/S、10 mM毛喉素）替换培养基。

d.在37 ℃，5%CO2条件下培养293T细胞48小时。

e.收获含有慢病毒的上清液，用0.45 μm亲水性聚偏二氟乙烯（PVDF）膜过滤。

f.以50000 g超速离心2小时，浓缩含有慢病毒的上清液。

g.弃去上清液。

h.在50000 g下超速离心10分钟。

i.弃去上清液。

j.用100 mL含L-Gln、丙酮酸钠和HEPES的DMEM/Ham's F-12液体悬浮沉淀，并将其转移至1.5mL试管中。

k.在10000 g下离心5 min。

l.将上清液转移至新的1.5 mL试管中。

m.将含慢病毒的上清液保持在-80℃最多6个月。

实验步骤

胰腺癌类器官的建立：2h

1.手术切除的PDAC肿瘤标本。

2.将肿瘤标本置于4℃的MACS组织保存液中。

3.将肿瘤标本放置在细胞培养皿中。

4.将类器官基础培养基添加到培养皿中。

5.去除旧培养基。

6.重复步骤4和5三次。

7.将肿瘤标本切成2-4 mm大小的小块。

8.用类器官基础培养基收集肿瘤碎片后，将其转移到15 mL试管中。

9.在200 g下离心3分钟。

10.制备MACS肿瘤解离酶混合物：a.在4.7 mL的RPMI1640中加入200 μL酶H、100 μL酶R和50 μL酶A。b.将酶混合物保存在4℃，直到投入使用。

11.去掉上清液。

12.用MACS肿瘤解离酶重新悬浮肿瘤碎片，并将它们转移到GentleMACS C管中。

13.将GentleMACS C管连接到gentleMACS分离器上。

14.用GentleMACS程序‘37℃_h_TDK_3’解离肿瘤碎片。注意：为软肿瘤标本选择gentleMACS程序“37℃_h_TDK_2”。注：肿瘤碎片的前后图像如图1A所示。对于软肿瘤标本，选择温和的MACS程序“37C_h_TDK_2”。由于纤维化，硬肿瘤呈白色外观。另一方面，由于血管增多，软肿瘤的外观更为粉红色（图1B）。

图1. 来自PDAC患者标本的胰腺癌类器官的产生。A：肿瘤碎片的前后图片。B：由于纤维化，硬肿瘤呈白色；由于脉管系统增加，软肿瘤的外观呈粉红色。C：gentleMACS解离剂处理后肿瘤的离心悬浮液为透明的，说明大多数细胞是胰腺癌细胞。D：胰腺癌类器官在1-2周内产生。

15.用基质胶GFR包被24孔培养板。a.每孔加入1 mL PBS（-）。b.取出PBS（-）。c.向24孔培养板中每孔加入100 μL基质胶GFR。d.在37℃下孵育15 min。注：步骤15的a-c应在冰上进行。

16.程序终止后，从gentleMACS分离器中取出gentleMACS C管。

17.将解离的肿瘤细胞悬液转移至安装在50 mL试管上的MACS SmartStrainer中。18.用20 mL类器官基础培养基清洗细胞MACS SmartStrainer。

19.以200 g离心3 min。

20.去除上清液。

21.重复步骤18和19三次。注：如果上清液混浊，则可能表明存在胰腺腺泡细胞。由于胰腺腺泡细胞分泌的消化酶，胰腺腺泡细胞的污染引起基质胶的消化。因此，有必要增加清洗次数以完全清除胰腺腺泡细胞。此外，浑浊的上清液也由其他因素如真菌或细菌污染引起。因此，建议在显微镜下对上清液进行确认（图1C）。

22.用100 μL基质胶GFR混悬PDAC细胞团块，并置于基质胶包被的24孔培养板中。注：如果获得的细胞数较少，则用50 μL基质胶GFR悬浮PDAC细胞团块，并将其直接铺板于塑料平板上。在这种情况下，可以省略步骤15。

23.在37℃下孵育15 min。

24.向每个孔中加入800 μL类器官培养基。

25.在37℃，加湿5%CO2培养箱中培养（图1D）。a.每48小时更新一次培养基。注意事项：如果您计划根据本方案进行耐药试验或再增殖试验，您可以使用携带CSII-EF-Luc-IRES 2-EGFP或CSII-EF-SecNanoluc-IRES 2-hKuO 1的慢病毒将荧光素酶或secNanoluc基因导入PCO。暂停点：此步骤中生成的PCO可储存在液氮中。

由人iPSC分化形成内皮细胞：17天

26.收获制备的hiPSC。a.丢弃培养基。b.加入10 mL PBS（-）。c.丢弃PBS（-）。d.加入2 mL Accutase。e.在37 ℃和5%CO2条件下孵育8分钟。f.从培养皿中收获解离的hiPSC，置于50 mL试管中。g.用10 mL AK02N清洗培养皿，并转移至同一试管中。h.在200 g下离心3分钟。i.除去上清液。j.用4 mL AK02N重悬hiPSC。k.计数。

27.将8.0×10^5个hiPSC转移至50 mL试管中。

28.用9 mL AK02N重悬，加入9 μL 10 mM Y-27632和25 μL iMatrix511。

29.将细胞铺板于55 cm2培养皿中。关键：加入iMatrix511后立即将细胞悬液铺板，以避免iMatrix511吸附到离心管上。

30.在37℃，5%CO2培养箱中孵育24小时。

31.将培养基更换为中胚层诱导培养基。

32.孵育72小时。a.48小时后，更新培养基。

33.将培养基更换为内皮细胞（EC）诱导培养基。

34.在37 ℃，5%CO2培养6天。a.每24小时更新一次培养基。

35.将分化的细胞重新铺板。a.去除培养基。b.加入10 mL PBS（-）。c.取出PBS（-）。d.加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA。e.在37℃，5%CO2下孵育5分钟。f.从培养皿中收获分化细胞，并将其转移至50 mL试管中。g.用10 mL胰蛋白酶-EDTA反应终止液冲洗培养皿，并转移至同一管中。h.在200 g下离心3分钟。i.弃去上清液。j.用4 mL EC维持培养基重悬分化的细胞。关键：确保使用EC维持培养基重悬细胞。细胞悬液中FBS的污染导致间充质细胞附着在培养皿上。要点：在此步骤中，EC可储存在液氮中。k.计数。l.将1.0×10^6个细胞转移至50 mL试管中。m.向每个培养皿中加入10 mL内皮细胞维持培养基和25 μL iMatrix511。n.将细胞接种至100 cm2培养皿中。

36.37℃，5%CO2条件下培养24小时。

37.将培养基更换为MiraCell EC培养基。

38.37℃，5%CO2条件下培养6天。a.每72小时更新一次培养基。注意事项：建议在分化终点当天使用分化的EC生成FPCO，以稳定实验之间内皮细胞的状态。如果需要更改使用时间，可以更改hiPSC分化的开始时间。此外，在步骤35j中，可以将hiPSC内皮细胞储存在液氮中。如果使用冷冻储备液，在共培养前7天重新开始培养。注：建议流式细胞仪检测CD31+/CD144+/KDR+/CD140b-比值大于90%，以验证内皮细胞分化效率。在诱导结束时，内皮细胞的融合率接近100%，但这并不影响内皮细胞的存活率、增殖能力和标记基因的表达。

从人iPSC分化间充质细胞：10天

39.用步骤26至32a诱导hiPSC分化为中胚层细胞。

40.将培养基更换为间充质细胞诱导培养基A。

41.在37℃，5%CO2培养48小时。a.每24小时更新一次培养基。

42.将分化的细胞重新铺板。a.用溶于ddH2O的0.1%明胶包被新的培养板。①在37℃下孵育1小时。②在步骤42 m的细胞接种前，从培养板中除去0.1%明胶。b.弃去分化细胞的培养基。c.加入10 mL PBS（-）。d.去除PBS（-）。e.加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA。f.在37℃，5%CO2下孵育3分钟。g.从培养皿中收获分化细胞，并将其转移至50 mL试管中。h.用10 mL胰蛋白酶-EDTA反应终止液冲洗培养皿，并转移至同一管中。i.在200 xg下离心3分钟。j.除去上清液。k.用4 mL MC诱导培养基A重悬分化细胞。暂停点：在此步骤中，间充质细胞可储存在液氮中。l.计数。m.将1.2×10^6细胞接种至明胶包被的培养皿中，培养皿中含有10 mL含10 μM Y-27632的间充质细胞诱导培养基A。

43. 37℃，5%CO2培养24小时。

44.将培养基更换为MC诱导培养基B。

45. 37℃，5%CO2培养72小时。a.每24小时更新一次培养基。注意事项：建议在分化终点当天使用分化的间充质细胞生成FPCO，以稳定实验之间间充质细胞的状态。如果需要更改使用时间，可以更改hiPSC差异化的开始时间。此外，在步骤42k中，间充质细胞可以储存在液氮中。可以在共培养前4天重新开始间充质细胞培养。注：推荐流式细胞仪检测CD73+/CD90+/CD140b+/CD166+≥90%，以验证间充质细胞的分化效率。诱导结束时，间充质细胞的融合率接近100%，但对间充质细胞的活力、增殖能力和标志基因的表达无明显影响。

图2. hiPSC分化为间充质细胞和内皮细胞。使用不同的培养基独立诱导每种细胞类型的形成。内皮细胞为CD31+/CD144+/KDR+/ CD140b-细胞，而间充质细胞为CD73+/CD90+/CD140b+/CD166+细胞。

增殖性FPCO的产生：4天

46.从PDAC类器官中收获胰腺癌细胞。a.弃去孔中的培养基，不破坏基质胶。b.使用细胞刮刀刮除基质胶。c.加入1 mL含10 μM Y-27632的TrypLE Express酶，并将混合物转移至15 mL试管中。d.为了去除基质胶簇，上下吸移5次。注：松动不充分会导致基质胶消化不良。e.在37℃水浴中孵育8分钟。f.为确保适当混合，在步骤46e中每2分钟翻转一次试管。g.以200 g离心3 min。h.弃去上清液，然后加入1 mL含10 μM Y-27632的accutase，并通过上下移液混合。i.在37℃水浴60分钟。j.在步骤46i期间，通过每10分钟上下吸移混合物来确保细胞悬浮液的适当混合。k.在200 g下离心3分钟。l.弃去上清液，然后加入5 mL类器官碱性培养基，并通过移液混合以稀释accutase。在200 g下离心3分钟。m.移去上清液，用2 mL类器官基础培养基重悬。n.计算PDAC细胞的数量。

47.收获hiPSC衍生的内皮细胞和间充质细胞。a.从培养皿中弃去培养基。b.加入10 mL PBS（-）。C.去处PBS（-）。d.加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA。e.在37 ℃，5% CO2条件下，内皮细胞孵育1分钟，间充质细胞孵育3分钟。f.收获细胞悬液，并将其转移至50 mL试管中。g.用10 mL DMEM（10%FBS，1%P/S）清洗培养皿，并将其转移至相同的50 mL试管中。h.在200 g下离心3分钟。i.去除上清液，然后加入5 mL DMEM（10% FBS，1% P/S）。j.计数。

48.准备Elplasia板。a.向所有孔中加入1 mL PBS（-）。b.在400 g下离心3分钟。

49.将PDAC细胞悬液（1.2×10^5）、内皮细胞（8.4×10^4）和间充质细胞（2.4×10^5）混合，生成一个FPCO。

50.以200 g离心3分钟。

51.弃去上清液，然后用1 mL含10 μM Y-27632/FPCO的细胞因子减少的FPCO培养基重悬。注：在细胞因子减少的FPCO培养基中使用旧EGM会损害FPCO的形成。因此，制备好的EGM应分装、冷冻保存，并在一个月内使用。

52.弃去Elplasia平板孔中的PBS（-）。

53.将1 mL细胞悬液转移至Elplasia平板的每个孔中。

54.在37℃，5%CO2下孵育24小时。

55.将细胞培养插入物置于12孔细胞培养板中。

56.使用移液器转移Elplasia平板一个孔中生成的多细胞球体，并转移至每个FPCO的1.5 mL试管中。

57.以200 g离心3分钟。

58.弃去上清液，留下约10 mL培养基。

59.重新悬浮并生成球状体液滴。a.在20 mL移液器的吸头中缓慢混合内容物。b.待多细胞球体下降至移液器尖端，然后制备充满多细胞球体的液滴（液滴应约为3-5 mL）。注意事项：通过快速吸取和轻轻吸取的重复过程促进球状体液滴的有效产生（图3A和3B）。

60.将含球体的液滴置于细胞培养插入物上。注：可将三个含球体的液滴置于一个细胞培养插入物中（图3C）。

图3. 使用多细胞球体生成FPCO。快速移液和轻轻移液的重复过程促进了球状体液滴的高效产生（A-B）。三个含有球状体的液滴可以放置在一个细胞培养插入物中（C）。pFPCO和qFPCO的特性大约在4天内形成，可维持约1个月（D）。

61.在细胞培养插入物下方加入600 mL含10 μM Y-27632的FPCO培养基。

62.在37℃，5%CO2下处理24 h。

63.用FPCO培养基更换培养基。

64.在37℃，5%CO2下处理48 h。a.每24小时更新一次培养基。

静态FPCO的产生：7天

66.用细胞因子减少的FPCO培养基替换培养基。

67. 在37 ℃，5%CO2下培养5天。a.每24小时更新培养基。

FPCO的耐药性试验：7-10天

68.按照步骤46至64a或65至67a，使用荧光素酶诱导的PCO生成pFPCO或qFPCO。

69.用FPCO培养基或含有抗癌药物的细胞因子减少的FPCO培养基（例如，吉西他滨、5-氟尿嘧啶、紫杉醇）。

70.在37℃，5%CO2下培养72小时。a.每24小时更新一次培养基。

71.向细胞培养插入物中加入1 mL PBS（-）。

72.使用移液器将FPCO与插入物分离，并将其转移至2 mL圆底试管中。

73.加入100 μL 1X Glo裂解缓冲液和两个4 mm氧化锆微珠。

74.使用TissueLyser LT系统以50/s的速度裂解FPCO，持续3分钟

75.将FPCO裂解物在-80℃下冷冻。

76.在25℃，解冻FPCO溶胞产物。

77.重复步骤74至76三次。

78.混合相同量的FPCO裂解物和ONE-Glo荧光素酶试验底物。

79.在黑暗的地方，25℃孵育5分钟。

80.使用GloMax Explorer系统测量发光强度。

FPCO的再增殖测定：1个月

81.按照步骤46至64a或65至67，使用secNanoluc诱导PCO生成pFPCO或qFPCO。

82.用FPCO培养基或含1 μM吉西他滨的细胞因子减少的FPCO培养基替换培养基。

83.在37℃，5%CO2下培养48小时。a.每24小时更新一次培养基。

84.用FPCO培养基或细胞因子减少的FPCO培养基替换培养基。

85.在37℃，5%CO2下培养1个月。a.每24小时更新一次培养基。b.定期收获上清液，并在-80℃下储存。

86.按照生产商的方案制备Nano-Glo荧光素酶检测试剂。

87.将Nano-Glo荧光素酶检测试剂与FPCO上清液按相同比例混合。注：一般情况下，建议使用来自一个FPCO的上清液进行50：1的稀释比。

88.使用GloMax Explorer系统测量发光强度。

FPCO的石蜡包埋：1天

89.按照步骤46至64a或65至67生成pFPCO或qFPCO。

90.使用移液器将FPCO从插入物上分离，并将其转移至尼龙网样品袋中（图4A）。

图4. 苏木精和伊红染色以及免疫荧光染色对FPCO进行组织学分析。FPCO的苏木精和伊红染色图像以及FPCO基质中IL6阳性iCAF、α-平滑肌肌动蛋白阳性myCAF和CD74阳性apCAF的免疫荧光图像。

91.使用热封机封闭尼龙网样品袋。

92.将含有FPCO的尼龙网样品袋转移至包埋盒中。

93.将包埋盒转移至染色缸中。

94.向染色缸中加入20 mL 30%乙醇。

95.10 min后，弃去旧乙醇。

96.重复步骤94至95两次。

97.向染色缸中加入50%乙醇。

98.60 min后，弃去旧乙醇。

99.使用Tissue-Tek VIP-5-Jr系统按照下述过程顺序处理样本。a.在37℃下用100%乙醇处理样品; P/V：开；混合：慢。b.重复步骤99a六次。c.在37℃下用100%二甲苯处理样品; P/V：关闭；混合：慢速。d.重复步骤99c两次。e.在63℃下用石蜡处理样品; P/V：关闭；混合：慢速。f.在63℃下用石蜡处理样品;P/V：开；混合：慢。g.重复步骤99f三次。

100.将处理后的样品置于包埋皿中，并将其包埋在石蜡中。

101.将试块切成5 μm厚的部分。

FPCO的组织学分析：2天

102.将薄切片预热至60℃ 10分钟。

103.按照下述顺序对薄片进行脱蜡和再水化：a.在25℃下用100%二甲苯溶解石蜡。b.在100℃下加热10分钟。重复步骤103 a两次。c.在25℃下，在100%乙醇中对薄切片进行脱蜡持续1分钟。d.重复步骤103c。e.在25℃下，将薄片在95%乙醇中再水化持续1分钟。f.在25℃下，将薄片在90%乙醇中再水化，持续1分钟。g.在25℃下，将薄片在80%乙醇中再水化持续1分钟。h.在25℃下，将薄片在70%乙醇中再水化持续1分钟。i.在25℃下，将薄片在50%乙醇中再水化，持续1分钟。j.用自来水清洗薄切片。

104.用50%Mayer's苏木精溶液对样品染色4分钟。

105.立即用水清洗样品。

106.继续用自来水冲洗样品15分钟。

107.用50%伊红溶液对样品染色40 s。

108.用70%乙醇快速冲洗样品。

109.用95%乙醇快速清洗样品。

110.使用100%乙醇使样品脱水5分钟。

111.重复步骤110两次。

112.用100%二甲苯清洗样品10分钟。

113.重复执行步骤112两次。

114.使用Mount-Quick封片。

FPCO的免疫荧光染色：2天

115.在步骤102至103之后，对薄切片进行脱石蜡和再水化。

116.在121℃高压灭菌器中进行抗原修复使用0.01M柠檬酸缓冲液（pH = 6），在20℃下处理20分钟。

117.使切片在25℃持续1小时。

118.在25℃下，在含0.05%吐温20的PBS中透化薄切片持续5分钟。

119.重复步骤118两次。

120.在25℃下，用无血清的蛋白封闭剂封闭1小时。

121.加入用蛋白质封闭剂（无血清液体形式）稀释的一抗。

122.在4℃下孵育16h。

123.弃去旧的一抗。

124.加入PBS（-）清洗薄切片。

125.静置5分钟。

126.重复步骤124至125两次。

127.加入用无血清蛋白质封闭剂稀释的二抗。

128.在25℃下孵育1小时。

129.弃去旧的二抗。

130.重复步骤124至125三次。

131.在25℃下，用含0.1% DAPI的Apathy封片剂封片5分钟。

故障排除

问题1：FPCO迅速聚集（例如，第1-2天），并且PDAC细胞暴露于FPCO表面。

可能的解决方案：保持气液界面（ALI）的状态对于FPCO的建立非常重要。为避免培养基渗入小室内部，下腔填充极少量的培养基（例如，12孔：600 μL，24孔：400 μL）。如果由于下部空间中的培养基过多而导致培养基渗入嵌件，则无法维持ALI环境，并且FPCO的形成效率低下。

问题2：未分化细胞存在于hiPSC来源的间充质和内皮细胞中。

可能的解决方案：hiPSC的分化潜能受传代数的显著影响。请勿使用在步骤26中传代超过25次的hiPSC。

问题3：在步骤35至37中，内皮细胞可能被间充质细胞样细胞污染。

可能的解决方案：步骤35j中用于重悬细胞的培养基不应含有FBS；相反，它应该是EC维护培养基。培养基中存在FBS导致间充质细胞样细胞附着在培养皿上。

材料和设备

参考文献

Takeuchi K, Tabe S, Yamamoto Y, Takahashi K, Matsuo M, Ueno Y, Ohtsuka M, Morinaga S, Miyagi Y, Yamaguchi T, Tanimizu N, Taniguchi H. Protocol for generating a pancreatic cancer organoid associated with heterogeneous tumor microenvironment. STAR Protoc. 2025 Jan 7;6(1):103539. doi: 10.1016/j.xpro.2024.103539. Epub ahead of print. PMID: 39772386.

武汉大学口腔医院尚政军团队高分综述：类器官技术如何帮助我们更好地理解口腔健康

来源：培养盒守护者