摘要：由于细胞之间的异质性，不同的细胞对某些药物有不同的反应。尽管使用传统小型化微量滴定板进行药物筛选已经很好地建立起来并且易于执行，但单细胞药物筛选仍然面临一些技术障碍，包括在开放环境中分散液体的不受控制的蒸发。传统的小型化微滴定板只能静态培养细胞，这限制了它们的

由于细胞之间的异质性，不同的细胞对某些药物有不同的反应。尽管使用传统小型化微量滴定板进行药物筛选已经很好地建立起来并且易于执行，但单细胞药物筛选仍然面临一些技术障碍，包括在开放环境中分散液体的不受控制的蒸发。传统的小型化微滴定板只能静态培养细胞，这限制了它们的适用性，因为这种方法无法模拟自然的细胞外微环境。相比之下，微流体装置可以通过连续输注进行3D细胞培养，使其能够模拟体内与细胞生理学相关的微环境，同时具有低样品消耗、低成本和高通量的优点。Brouzes等人提出了一种基于液滴的微流体装置，可以实现药物库对U937细胞的细胞毒性作用。在他们的方法中，他们首先用独特的荧光标记药物浓度库，并将其与含有单细胞的液滴结合。将合并的液滴孵育24小时，然后注射到另一个设备中，与含有细胞活性荧光染料的液滴融合，然后在芯片上短暂孵育。最后，进行荧光分析以揭示单细胞的异质性。由于其精确的细胞包封、高通量液滴的产生和操作，以及用于联合筛选的潜力，该设备代表了单细胞药物筛选的理想平台。最近，Scheler等人开发了一种基于液滴的数字最小抑菌浓度筛选，作为量化抗生素表型反应的单细胞分布的实用分析平台，并允许高精度地测量接种物效应（图8A）。根据头孢噻肟治疗携带β-内酰胺酶的大肠杆菌的结果，他们发现抗生素疗效取决于每个细菌菌落形成单位使用的抗生素量，而不是绝对抗生素浓度。

与流式细胞术分析不同，单细胞药物筛选试验是使用微滴方法进行的，其中将选定的化合物添加到分离的单个细胞中，而不是添加到细胞群中。这使得细胞之间的相互作用得以避免，并且由于不同的细胞对药物具有不同的敏感性，因此有可能从细胞群中分离出耐药细胞以进行进一步分析，从而有可能为癌症早期治疗的新药开发提供条件。例如，Sarkar等人使用集成微流体液滴阵列平台分析了阿霉素在野生型和耐阿霉素乳腺癌症细胞中的摄取和细胞毒性（图8B）。他们发现，在存在或不存在阿霉素（Dox）的情况下，药敏细胞比耐药细胞更容易死亡。他们还观察到单个药物敏感细胞的多相摄取，而耐药细胞的摄取和保留率较低。Bithi等人提出了一种基于移液管的微流体细胞分离技术，用于生成微滴阵列。他们的平台可用于小样本体积内少量肿瘤细胞或肿瘤细胞簇的单细胞药物分析。他们使用该平台对肿瘤细胞对阿霉素的反应进行了单细胞分析，发现尽管单个肿瘤细胞的药物摄取不同，但凋亡的发生是由阿霉素关键细胞内浓度的积累决定的。他们的方法为理解肿瘤细胞-药物相互作用提供了一个理想的平台。

单细胞遗传分析

细胞之间的遗传差异在发育、分化、信号转导和疾病中非常显著，开发单细胞基因分析方法来探索这些生命过程非常重要。除了单细胞分离外，液滴微流体还成为分离单细胞基因组的有前景的工具，使其成为细胞生物学和临床医学单细胞基因组学高通量研究的理想技术。

Lan等人描述了一种使用微流控液滴技术进行超高通量单细胞基因组测序的方法（图9A）。在他们的方法中，单个细胞被包裹在微凝胶中，微凝胶可以渗透酶、洗涤剂和水力直径小于其孔径的小分子等分子，但也可以在空间上捕获基因组DNA等大分子。微凝胶的使用有助于清洁包封的细胞，以执行必要的步骤，如细胞裂解和基因组处理，同时保持单个基因组的分离。使用他们的方法，他们很容易对包封的细胞进行一系列操作，如细胞裂解和基因组处理，同时保持单个基因组之间的分区。通过将微凝胶和微流控液滴技术相结合，他们的方法可以在短时间内处理5万个细胞，实现超高通量单细胞基因组测序。然而，它们的封装过程遵循泊松分布，导致封装率低。此外，Moon等人开发了一种新的液滴微流体平台，其中含有寡核苷酸条形码的高浓度微珠在惯性作用下自发排列在螺旋通道中，然后与液滴中的单个细胞共封装以进行单细胞测序（图9B）。通过惯性有序珠的确定性封装，他们的平台显著提高了吞吐量并减少了条形码错误，相对于非确定性Drop-seq系统，显著减少了多珠包装中的间歇性错误。Guo等人开发了一种快速、无PCR的单细胞miRNA检测方法，在带有光电倍增管（PMT）传感器的液滴微流体平台中使用DNA杂交链式反应扩增靶miRNA信号（图9C），其中单细胞和裂解物被包裹在液滴中，单个细胞释放的靶miRNA与DNA放大器相互作用，引发杂交反应并产生荧光信号。靶序列在不使用PCR热循环的情况下循环，以显著放大荧光信号。他们的方法有效地将实验室台式PCR分析转化为实时液滴分析，使用反应后荧光进行读取，以实现超高通量单细胞测序（每分钟300-500个细胞），用于快速生物医学鉴定。此外，Segaliny等人报道了一种单细胞液滴微流体方法，通过动态监测TCR T细胞活化、逆转录PCR和单细胞水平的TCR链测序来鉴定表达工程化T细胞受体（TCR）的T细胞。

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最近，基于单细胞液滴微流体的遗传分析越来越多地被研究学者应用于临床诊断。Rivello等人描述了一种研究与转移性疾病相关的循环基质细胞代谢的通用方法，以使用基于液滴的微流体芯片揭示前列腺癌症的预后。他们对转移性癌症前列腺患者的单细胞进行液滴内细胞外pH测量，以检测和分离高代谢活性细胞（HMCs）。然后对HMCs进行单细胞mRNA测序分析，结果显示约87%是高代谢的循环基质细胞。Kaplan-Meier分析显示，HMCs超过5的患者的生存概率明显低于HMCs少于5的患者。因此，HMCs可能是癌症预后不良的指标。单细胞液滴微流体方法对前列腺癌症的诊断具有潜在的实用性。此外，王的团队建立了一个基于单细胞液滴的微流体系统，用于临床尿液样本的病原体鉴定和抗菌药物敏感性测试（图9D）。使用153个荧光杂交探针检测微滴中单个细菌的16S核糖体RNA（16S rRNA），从而在16分钟内从临床尿液样本中分子鉴别尿致病菌，并定量指示细菌对抗生素的敏感性。微流体系统在短周转时间（

在这篇综述中，我们介绍并讨论了单细胞液滴微流体在生物医学应用方面的最新进展。微流体液滴技术从重要优势、无量纲数、装置几何形状和液滴产生等方面进行了介绍。描述并讨论了基于随机或受控模式在液滴中以及使用合成或天然聚合物在水凝胶中用于单细胞包封的各种最新微流控液滴操纵方法。最后，我们总结了单细胞液滴微流体在小分子检测、蛋白质分析、药物筛选和遗传分析中的重要应用。

尽管使用微流控液滴技术在单细胞操作和分析方面取得了一些进展，但仍然存在瓶颈。首先，微流控液滴技术的单细胞包封率较低，用于单细胞分析的检测工具在数量上仍然有限，灵敏度相对较低。开发更简单、更便宜、更集成的液滴微流体装置将显著改善单细胞分析。此外，用于包封单细胞的凝胶材料在功能上是有限的，有必要开发用于培养的多复合/功能凝胶材料，以有效地重建体内细胞的3D微环境，用于单细胞的高通量分析。最后，细胞本身的复杂性以及单细胞分析的当前趋势涉及多模式表征的事实，鼓励了同步检测更多类型细胞间分子的方法的发展。这些挑战将促进液滴微流体在操作和检测目的以及多组分单细胞分析中的进一步发展，为单细胞的进一步生物医学研究提供科学依据，并导致对生物过程中涉及的分子的功能和调控机制的更准确和全面的理解。

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来源：科学搬运员