摘要：中国人以白为美的传统审美观念，使美白化妆品成为国内护肤品市场中最活跃的领域之一。而基于中国人皮肤黑色素的合成代谢特性开发适合中国人皮肤的美自化妆品，也必将是未来美白化妆品的研发方向。近年来，随着生物医学技术在医药、食品等领域的快速发展，分子药理学技术在化妆品安
中国人以白为美的传统审美观念，使美白化妆品成为国内护肤品市场中最活跃的领域之一。而基于中国人皮肤黑色素的合成代谢特性开发适合中国人皮肤的美自化妆品，也必将是未来美白化妆品的研发方向。近年来，随着生物医学技术在医药、食品等领域的快速发展，分子药理学技术在化妆品安全性和功效性评价等领域中得到了推广和应用。而欧盟禁止化妆品动物实验，提倡用动物替代实验进行化妆品评价，也使体外细胞水平评价成为检验化妆品功效的重要手段。美白类化妆品体外细胞水平评价体系的建立，将为该类化妆品的研发及应用提供指导。
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美白功效评价细胞模型的建立
1、黑色素瘤细胞模型
早期采用小鼠B16黑色素瘤细胞模型进行美白剂筛选和评价。B16细胞为筛选美白剂的首选细胞，其次为人表皮黑素瘤细胞A375细胞，但B16、A375为肿瘤来源细胞，与人体正常黑色素细胞存在生理生化反应上的差异，仅用于美白剂的大规模或高通量初步筛选。
2、黑色素细胞模型
从活检获取的正常皮肤材料中原代培养的人表皮黑色素细胞(HumanEpidermalMelanocytes，HEM)，其分裂增殖能力强、标准化程度高、批间差异小，具有与体内相同的产生黑色素颗粒的功能。HEM在医学上被用作色素类疾病的药物体外筛选模型，目前也被用于美白剂的大规模筛选和细胞毒性评价。HEM细胞模型可以从定性和定量两方面评价待测物质的毒性作用和美白功效。
3、含黑色素的重建皮肤模型
与单层细胞相比，HEM与多种皮肤细胞在生物支架或材料上共培养建立的三维或重构皮肤模型模拟了正常皮肤的结构，可用于评估黑色素形成过程中多种细胞相互作用，也便于控制培养条件，探索美白剂的作用机制。
美白功效在体外模型上的评价
1、黑色素合成测定
1）黑色素细胞活力
美白剂作用后的黑色素细胞，其数量和活力的变化反映了美白剂的效果。用光学显微镜观察美白剂作用后的黑色素或黑色素瘤模型细胞状态MTT(四唑盐比色法)观察美白剂对模型细胞的体外增殖能力的影响，可初步评价美白剂的细胞毒性作用及对黑素细胞的生长抑制作用。
2）黑素含量测定
将黑素瘤细胞用葡糖胺培养至完全白化，再加入茶碱促细胞回复到黑色素合成状态，同时加入试样，镜检细胞颗粒的色调判断样品对新生的黑色素抑制/促进效果。最后对细胞颗粒进行离心分离使细胞内颗粒释放出来，分光光度法进行黑色素总量的测定。
3）黑素合成相关因子测定
酪氨酸酶(Tyrosinase，TYR)是黑色素合成途径中的主要限速酶，主要通过影响酪氨酸转化成多巴，以及多巴氧化为多巴醌来影响黑色素的生成其酶活性的大小决定黑色素的数量。一些美白剂如曲酸及熊果苷等，通过抑制TYR的活性来抑制黑色素的生成。因此，可以通过测定美白剂对TYR的抑制结果来评价其功效。TYR活性检测方法有放射性同位素法、免疫学法和生化酶学法，最常用的为生化酶学法。
2、黑色素转运能力测定
抑制黑色素从表皮黑色素细胞向角质细胞的转移和分布可用于评价化妆品的美白功效。黑色素生成后的转移分为两步，胞内转移和胞外转移。胞内转移是黑色素细胞受内分泌或紫外等刺激产生的黑色素体，包裹在黑色素细胞中向突起末端迁移。这个过程需要分布于细胞树突微管上的微管发动蛋白推进。其中小眼畸形相关转录因子(MicrophthalmiaAssociatedTranscriptionFactorMITF)是黑素细胞生长、分化及色素生成的主要调节蛋白，MITF通过控制角质细胞中捕获黑色素体的蛋白的表达在黑色素体转移中发挥作用。根据黑色素转运通路，可从抑制黑色素细胞突起形成、阻碍角质细胞对黑色素的摄取、抑制角质细胞吞噬活性或作用于MITF抑制黑色素转运等关键步骤设计实验研究美白剂的作用。对MITF的定量检测可以反应出黑色素的胞内转移能力，其检测可采用WesternBlot半定量法和商品化ELISA定量试剂盒。
3、角质细胞黑色素摄取测定
黑素前体蛋白Pmel17/gp100是一种黑素细胞特异性蛋白，在黑素细胞的分化与成熟中起到重要作用，Pmel17是跨膜蛋白，其细胞外部分可以从黑素小体上脱落而被释放到培养基中，采用ELISA法可以测定培养液中脱落的可溶性Pmel17浓度，从而作为黑色素转运能力的检测指标。
4、三维皮肤模型整体模拟评价
将待测物直接涂布于含有黑色素细胞的人工皮肤模型表面，作用一段时间后，检测深层的黑色素细胞的变化，检测指标包括黑色素颗粒的定量、酪氨酸酶活性测定、黑色素特异性抗原Melan-A/MART-1免疫荧光分析等。还可利用像素分析软件定量检测角质细胞摄取黑色素的量，以及检测培养基中的角质细胞释放的细胞炎症因子的变化等。三维皮肤模型上的评价技术结合了体外单层细胞模型上生化及分子生物学检测技术，以及动物、人体实验的体内评价方法，可对美白剂进行安全和功效的全面综合评价。
来源：Wen雯吖