摘要：DNA甲基化（DNA methylation）是DNA化学修饰的一种形式，是指DNA在DNA甲基转移酶（DNMT）的作用下将甲基选择性地添加到胞嘧啶（C）碱基上的过程。DNA甲基化能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现，是最重要的表观遗传调控方式之一。D
PART 1
DNA甲基化介绍
DNA甲基化（DNA methylation）是DNA化学修饰的一种形式，是指DNA在DNA甲基转移酶（DNMT）的作用下将甲基选择性地添加到胞嘧啶（C）碱基上的过程。DNA甲基化能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现，是最重要的表观遗传调控方式之一。DNA甲基化能引起染色体结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式改变，从而控制基因的表达。
DNA甲基化参与基因转录调控、细胞分化、胚胎发育、X染色体失活、基因印记和肿瘤的发生、衰老等许多生命活动的过程，是研究的热点，也在临床上得到了大量应用。
DNA甲基化位点/区域的定量是研究DNA甲基化至关重要的方法，但是过程复杂，涉及多个步骤，包括DNA提取、亚硫酸盐转化（Bisulfite）、引物设计和qPCR检测。其中引物设计是最为关键的一步，引物的质量决定实验结果和实验的成功。
PART 2
MSP引物的设计
对于甲基化特异性PCR（MSP）实验，需要两对引物，其中一对引物（M）能够对经亚硫酸氢盐修饰的甲基化DNA特异性扩增，另一对引物（U）则对亚硫酸氢盐修饰的非甲基化DNA特异。对于每个待研究的样本序列，用这两对引物分别进行PCR扩增，以此判断引物序列中特定CpG位点的甲基化水平。
图片来自文献：Gryzinska M , Rechulicz J , Batkowska J ,et al.Comparison of programs to design primers for Methylation-Specific PCR[J].Romanian Biotechnological Letters, 2019, 24(3):479-484.DOI:10.25083/rbl/24.3/479.484.
下面介绍利用MethPrimer网站对基因片段甲基化岛（CpG岛）预测与MSP实验M、U两对引物的设计方法。
一．输入基因片段模板原始序列（图1）
1. 打开MethPrimer网站主页（https://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi），输入基因片段原始序列于图一方框空白处，MSP引物设计选择绿色“Pick MSP Primers”选项。
2. 如需在预测CpG岛周围设计引物，则另外勾选“Use CpG island prediction for primer selection?”选项。
图1. 基因片段模板序列输入
二．常规引物选择参数设置（General Parameters for Primer Selection）
常规引物选择参数设置同时适用于BSP与MSP引物设计，且分为按需填写（图2）与必要填写（图3）两类：
1.按需填写常规引物选择参数设置（图2） ：
1）填写“Sequence name(optional)”选项，命名基因片段序列。
2）填写“Target (optional)”选项，在基因片段序列上指定一个正反向引物设计区域，该区域应不大于源序列最大尺寸，也可用“”标记源序列，如…ATCT[…CCGT…]ATCT…。
3）填写“Excluded regions (optional)”选项，在基因片段序列上指定一个避免引物设计的区域，也可用“”标记源序列，如…ATCTTCAT…。
4）选择“Number of output pairs (optional)”数量，即需要得到MSP引物对的个数，默认为5，上限为9，用户可按需自行选择。
图2. 按需填写常规引物选择参数设置
2. 必要填写常规引物选择参数设置（图3）：
1） 填写“Product Size”即PCR产物长度，该值通常小于常规PCR值。参数设置为最短100 bp，最长300 bp，最佳200 bp。
2） 填写“Primer Tm”即引物熔解温度，该值通常低于常规PCR的值。参数设置为最低50℃，最高65℃，最佳55℃。
3） 填写“Primer size”即引物长度，该值通常大于常规PCR的值。参数设置为最短18 bp，最长30 bp，最佳25 bp。
4） 填写“Product CpGs”即PCR产物覆盖CpG位点的最小数目，参数设置默认为4，用户可根据需要更改。
注：该参数对MSP引物设置无约束，但在BSP引物参数设置时，该参数越大，则通过一次PCR能够覆盖更多的CpG位点，因此能够测序得到更多CpG位点甲基化情况。
5） 填写“Primer Poly X”即引物序列中除“T”外的连续单核苷酸的最大允许数量，参数设置默认为5，用户可根据需要更改。
6） 填写“Primer Poly T”即引物序列中连续“T”(或反向引物中“A”)最大允许数量。这里的“T”既包括原始的“T”，也包括已转换为“T”的非CpG的“C”。参数设置默认为8，用户可根据需要更改。
7） 填写“Primer non-CpG 'C's：即引物中非CpG“C”的最小数量，这对于区分亚硫酸盐修饰和未修饰或未完全修饰的DNA非常重要。参数设置默认为4，用户可根据需要更改。
图3. 必要填写常规引物选择参数设置
三．MSP引物参数设置（Parameters for MSP primers）
为满足MSP两对引物能够特异性检测指定CpG位点甲基化/非甲基化水平的能力，MSP引物设计与参数选择应符合以下限制条件（图4）：
1. 填写“3’ CpG constraint”即CpG在引物3'端的位置参数：
1）该值默认设置为“3”，代表引物最后三个碱基中，至少有一个应该是CpG‘C’。
2）用户可按需指定CpG‘C’到引物3’末端的最大距离。
2. 填写“CpG in primer”即MSP引物中CpG的最小数量：
1）该值默认设置为“1”，即为最大限度地区分甲基化和非甲基化等位基因，引物应在最多3’端至少包含一个CpG位点，若引物中只有一个CpG，那么它一定在最3'端。
2）相比于仅包含最末端的一个CpG位点外，对于MSP引物设计来说，引物序列包含中更多CpG位点是更好的方案，因此用户可需增加MSP引物覆盖CpG位点的数量。
3. 填写“Max Tm difference”即甲基化（M）和未甲基化（U）引物对最大Tm差值:
1） 该值默认设置为“5℃”。
2）仅当用户想使用相同循环条件进行甲基化特异性PCR和非甲基化特异性PCR时，需设置此参数。
注：为使来自引物的PCR结果能够真正反映研究样品的DNA甲基化状态，引物对M和U应覆盖相同的CpG位点。
图4. MSP引物参数设置
4. 点击Submit按钮。
四．预测基因甲基化岛（CPG岛）与MSP引物设计结果
1. Methprimer网站预测基因CpG岛（图5）：
点击Submit按钮（图4），可见预测结果为在该基因片段有1个CpG岛，长度为125 bp。
图5. 基因片段CPG岛预测图
2. 对目标基因片段MSP引物设计结果（图6）：
图6. 目标基因片段MSP引物设计结果图
3. 基因片段序列经过亚硫酸氢盐修饰结果（图7）：
图7. 基因片段经亚硫酸氢盐转化结果图
对图7中符号说明： 1）上方序列（upper row）：代表原始基因序列。 2）下方序列（lower row）：代表经亚硫酸氢盐修饰序列，该图序列假设所有CpG位点均被甲基化。 3）“++”：代表甲基化（CpG）位点。 4）“：：：：”代表非甲基化（非CpG）“C”转换为“T”位点。 5）“M>>>>>>”或“M>>>>>”或“U
以上就是MethPrimer网站对基因片段CpG岛预测与MSP引物的设计流程。
参考文献
Li LC, Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 2002;18(11):1427-1431. doi:10.1093/bioinformatics/18.11.1427
Methylation-Specific PCR, Protocol; First Online: 01 January 2011, https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-61779-316-5_3
来源：科学言午