摘要：基因治疗为许多遗传性疾病提供了治愈的希望。肝脏作为人体重要的代谢器官，一直是基因治疗研究的重点之一。肝脏基因治疗不仅可以治疗许多与肝脏相关的遗传性疾病，如血友病和高氨血症等，而且具有极大的临床应用潜力。然而，尽管腺相关病毒（AAV，Adeno-Associat
引言
基因治疗为许多遗传性疾病提供了治愈的希望。肝脏作为人体重要的代谢器官，一直是基因治疗研究的重点之一。肝脏基因治疗不仅可以治疗许多与肝脏相关的遗传性疾病，如血友病和高氨血症等，而且具有极大的临床应用潜力。然而，尽管腺相关病毒（AAV，Adeno-Associated Virus）载体已在临床中应用广泛，尤其在血友病的治疗中取得了显著成果，但不同AAV载体在肝脏中的转导效率和特异性却存在着显著差异。更重要的是，肝脏疾病的不同病理状态，特别是脂肪肝（steatosis）的存在，可能对基因治疗的效果产生重要影响，这一问题长期未能得到有效解决。
近年来，随着技术的发展，研究者们逐步认识到脂肪肝的普遍性以及它对肝脏细胞功能的影响。脂肪肝不仅是全球最常见的慢性肝病之一，而且它的发生与多种疾病密切相关，如代谢综合症、糖尿病等。因此，如何针对脂肪肝患者优化基因治疗方案，成为了医学界亟待解决的重要问题。
1月29日Nature Biotechnology的研究报道“AAV capsid prioritization in normal and steatotic human livers maintained by machine perfusion”，采用常温体外灌注（normothermic machine perfusion，NMP），在模拟人体生理状态下对不同AAV载体的转导效率进行测试，研究不同肝脏病理状态下的AAV载体表现。通过对正常肝脏和脂肪肝肝脏的比较，研究人员发现，脂肪肝对AAV载体的转导效率和特异性有显著影响，不同AAV载体的转导表现也因病理状态的不同而变化。这一发现不仅为肝脏基因治疗提供了更加精准的治疗策略，也为个性化医学的实施提供了新的理论依据。
通过该研究，研究人员希望为未来的肝脏基因治疗开辟新的思路，特别是对于脂肪肝和其他肝脏疾病患者，如何在确保治疗安全的前提下，最大限度提高基因治疗的效果。这不仅为肝脏基因治疗的临床应用提供了理论支持，也为解决基因治疗中面临的技术难题指明了方向。
AAV载体在肝脏基因治疗中的应用前景
腺相关病毒（AAV，Adeno-Associated Virus）作为一种基因转导工具，在肝脏基因治疗中具有无可比拟的优势。与其他病毒载体相比，AAV载体具有低免疫原性、较高的肝脏细胞转导效率以及较长时间的基因表达，这使得它们成为肝脏基因治疗的首选载体。AAV载体的低免疫原性使其能够避免激发过度的免疫反应，这对于长期的基因表达至关重要，尤其是在肝脏这种容易受到免疫系统影响的器官中。
肝脏作为人体代谢和合成的重要器官，具备强大的再生能力，并能够容忍外来物质的长期存在，因此成为基因治疗的理想靶点。AAV能够高效地将治疗基因导入肝脏细胞，尤其是肝脏的主要细胞——肝细胞。AAV通过内吞作用进入肝脏细胞后，能够将基因递送至细胞核内，进行转录和表达。由于AAV载体的特性，它们能高效地在肝脏细胞中产生持续且稳定的基因表达，特别适用于那些需要长期表达的基因治疗方案。
目前AAV载体的应用：血友病治疗等经典案例
AAV载体在临床上的成功应用，尤其是在血友病的治疗中，已展现出巨大的潜力和前景。血友病是由血液中某些凝血因子缺乏引起的遗传性出血性疾病。通过基因治疗，AAV载体能够将编码凝血因子的基因直接导入患者的肝脏细胞，进而恢复血液的凝血功能。以AAV5载体为例，已经有多项研究和临床试验证明，AAV5载体能够在血友病B（凝血因子IX缺乏）患者中有效地转导肝脏细胞，并促使患者体内凝血因子IX的表达，从而显著减少了出血事件的发生。
除此之外，AAV载体在治疗血友病A（凝血因子VIII缺乏）中的成功应用也表明了其在肝脏基因治疗中的广泛潜力。AAV载体已被用来将凝血因子VIII的基因导入患者的肝脏，通过这种方式，患者可以持续地生产凝血因子VIII，显著降低了疾病的临床症状。通过这些案例，AAV载体不仅证明了其在特定遗传性疾病中的治疗效果，还为其他肝脏疾病的基因治疗提供了可靠的实践经验和理论基础。
然而，尽管AAV载体在这些经典案例中显示了显著的疗效，仍然存在一些挑战。例如，如何根据患者的不同病理状态选择合适的AAV载体，并确保治疗的长期效果，仍是基因治疗成功的关键。在肝脏基因治疗中，AAV载体的选择不仅仅依赖于其转导效率，还与患者的肝脏状态密切相关，如脂肪肝等病理状态可能会影响AAV载体的转导效率和基因表达的持久性。
脂肪肝对基因治疗的潜在影响
脂肪肝（steatosis）已成为全球范围内最为常见的慢性肝脏疾病之一。据统计，脂肪肝的患病率在全球范围内已超过30%，尤其是在发展中国家，随着肥胖症和糖尿病的流行，脂肪肝的发病率更是不断攀升。脂肪肝通常表现为肝脏内脂肪的异常积聚，若未能得到及时的干预，可能进展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH）甚至肝硬化，从而严重威胁患者的生命健康。
脂肪肝的危害不仅仅局限于肝脏本身，其与多种代谢性疾病密切相关，包括2型糖尿病、心血管疾病等。脂肪肝在全球范围内的流行，给公共卫生系统带来了巨大的压力，成为需要优先解决的健康挑战。随着脂肪肝的患病人群逐渐增大，如何有效治疗脂肪肝及其并发症，特别是如何通过基因治疗手段实现治疗，已成为医学界亟待解决的重要问题。
脂肪肝如何改变肝脏的细胞功能与代谢
脂肪肝不仅影响肝脏的结构，还会深刻改变肝脏的细胞功能与代谢。肝脏中的肝细胞（hepatocytes）是脂肪积聚的主要承载者，长期的脂肪积累会导致肝细胞的功能障碍，进而影响肝脏的正常代谢功能。脂肪肝的发生改变了肝脏细胞的脂质代谢，导致肝脏无法有效分解和清除过多的脂肪，从而引发肝脏的氧化压力，进而诱发炎症反应。
脂肪肝患者进行基因治疗时的特殊挑战
脂肪肝患者接受基因治疗时，面临着一系列特殊的挑战。首先，脂肪肝引发的代谢改变可能影响AAV载体的转导效率。研究表明，脂肪肝肝脏中的AAV载体转导效果明显低于正常肝脏，尤其是在肝脏的门脉区和中心区之间的转导效率存在显著差异。在正常肝脏中，AAV8载体主要转导门脉区的肝细胞，但在脂肪肝肝脏中，这种转导效率发生了改变，AAV5载体反而显示出对中心区肝细胞的优先转导能力。
此外，脂肪肝会影响基因治疗的长期效果。脂肪肝肝脏中的AAV载体转导效率低，可能导致基因治疗的持久性不如预期。根据研究数据，脂肪肝环境可能影响AAV载体的基因表达持久性和稳定性。尤其是在脂肪肝肝脏中，AAV载体转导后，基因表达的持续时间明显缩短，这可能与脂肪肝导致的肝脏微环境变化（如氧化压力、细胞膜性质改变）有关。
通过常温体外灌注（NMP）技术探索AAV载体
常温体外灌注（Normothermic Machine Perfusion，NMP）技术近年来被广泛应用于器官保存和功能评估，尤其在肝脏研究中展现出巨大潜力。这项技术通过模拟生理状态维持肝脏的代谢和功能，使得研究人员能够在接近真实生理条件下进行长期的实验研究。在该研究中，NMP技术被用于探讨不同AAV载体在正常和脂肪肝（steatotic）人类肝脏中的转导效率。通过将人类肝脏维持在正常生理状态下，研究人员能够真实地评估AAV载体在肝脏不同病理状态下的表现。
该技术通过灌注氧合血细胞、白蛋白、激素和营养物质等溶液，在24小时以上的时间内维持肝脏的生理活性。研究中使用的NMP系统能够确保肝脏在体外环境中保持正常的代谢和合成能力，如乳酸清除、葡萄糖代谢以及胆汁生成等。这使得NMP成为在接近临床条件下测试AAV载体效果的理想平台，并且能避免一些传统体外培养方法中的细胞损伤和功能丧失。
如何在模拟生理状态下测试AAV载体的效果
在该研究中，AAV载体的测试不再局限于单纯的体外细胞培养或动物模型，而是通过将正常与脂肪肝的人类肝脏灌注，确保实验条件尽可能模拟实际的生理环境。
实验中，AAV载体被注入到肝脏的门脉，随即通过肝脏灌注系统输送到肝脏细胞。这一过程能够高效地评估AAV载体的转导效率和特异性，因为NMP系统可以维持肝脏的正常代谢功能并模拟药物输送的实际效果。此外，研究人员通过实时监测灌注液中的乳酸水平、血糖水平、胆汁生成等指标，来评估肝脏在接受AAV载体后是否仍能维持正常的生理功能，从而确保基因治疗不仅是有效的，还能够长期持续。
正常与脂肪肝人类肝脏的比较实验
该研究的关键部分是通过常温体外灌注技术比较正常与脂肪肝（steatotic）人类肝脏在AAV载体转导过程中的差异。研究人员从健康的捐赠者处获取了正常的肝脏样本，并同时收集了患有脂肪肝的捐赠者的肝脏样本，进行平行实验。
在实验过程中，两组肝脏样本分别接受了不同的AAV载体（包括AAV8、AAV5、AAV-LK03、AAV6等）的灌注。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq），研究人员能够准确识别不同细胞类型（如肝细胞、内皮细胞、巨噬细胞等）在接受AAV载体后的转导情况。对比分析发现，脂肪肝条件下，AAV载体的转导效率和特异性与正常肝脏有显著差异。特别是在脂肪肝肝脏中，AAV5显示出比AAV8更高的转导效率，尤其是在肝脏的中心区，而AAV-LK03则表现出对脂肪肝肝脏的适应性较差。
研究还通过免疫荧光染色、流式细胞术以及数字PCR（ddPCR）等技术，进一步验证了这些差异。结果表明，脂肪肝状态下的肝脏细胞在AAV载体的转导效率上存在显著变化。
AAV8载体在正常人类肝脏中转导效率和特异性（Credit:Nature Biotechnology）
a. 插图展示与流向说明
通过插图展示了如何对人肝脏进行导管插入，并标明了血管和胆管的流动方向。图中黄色标示为门静脉，红色为肝动脉，蓝色为下腔静脉，而黑色箭头标示为胆管。此步骤为实验中的肝脏灌注提供了结构性指导，确保正确的流向和治疗区域。
b. 灌注后的图像对比
图b展示了灌注的NL 1（左）和AAV8-eYFP载体注入门静脉后的图像（右）。图中，门静脉导管被标为黄色，肝动脉和下腔静脉分别为红色和蓝色，而胆管则通过黑色箭头标示。这一展示直观地显示了AAV8-eYFP载体如何通过门静脉注入并到达肝脏的不同区域，为接下来的分析提供了视觉证据。
c. 肝脏功能和细胞活力
图c展示了在常温体外灌注（NMP）过程中，NL 1和NL 2肝脏的功能和细胞活力的变化。NL 2样本在60小时时，注入1单位的红细胞（PRBCs）导致乳酸增加，提示肝脏在灌注过程中可能经历了氧化压力或细胞代谢不完全的情况。而在NL 1中，由于胆管导管位置不正确，0到11小时间未记录到胆汁的生成。这个细节提醒我们，在进行肝脏灌注时，细节上的操作精度对实验结果和功能检测至关重要。
d. 单细胞RNA测序分析
图d展示了通过统一流形逼近和投影（UMAP）技术分析的6,959个肝脏细胞的结果，并根据细胞身份对其进行聚类。该分析结果帮助研究者从细胞群体层面识别不同类型的细胞及其特征，为后续的AAV8转导效率分析提供了基础。
e. AAV8+细胞分布与定量分析
图e展示了AAV8+细胞在单细胞RNA测序中的分布情况。左侧显示了AAV8+细胞在肝脏样本中的空间分布，右侧则展示了各细胞群体中AAV8+细胞的百分比和绝对数。该分析为后续AAV8转导特性提供了直观的定量数据。
f. 免疫荧光标记验证
图f展示了通过免疫荧光标记的结果，检测AAV8转导的细胞类型。在NL 2样本中，通过GFP（标记AAV8转导）、FAH（标记肝细胞）、CD31（标记内皮细胞）和CD68（标记单核细胞/巨噬细胞）对肝脏组织进行了标记。白色箭头指出那些既标记为GFP阳性又同时表达特定细胞类型标记物的细胞，表明AAV8成功地转导了这些细胞群体。
g. 流式细胞术定量分析
图g展示了流式细胞术分析的结果，通过定量AAV8转导的细胞，研究人员发现，经过62小时NMP灌注的NL 2样本中，AAV8转导的细胞比例可以通过流式细胞术得到精确计算。这些定量数据帮助研究者评估AAV8载体的转导效果和特异性。
h & i. AAV载体基因拷贝数与转基因mRNA表达
图h和i展示了NL 1和NL 2样本中，肝细胞和组织样本中的AAV载体基因拷贝数（h）和转基因mRNA表达水平（i）。NL 1样本注入了5.7×10¹²个AAV载体基因组，而NL 2注入了1.6×10¹³个AAV载体基因组。通过对比不同样本的基因拷贝数和mRNA表达，研究者可以评估AAV载体的转导效率和稳定性。
j. 原位杂交和免疫荧光联合分析
图j展示了对NL 1和NL 2样本中AAV载体DNA的原位杂交（ISH）结果。使用eGFP探针进行原位杂交，结合GFP免疫荧光标记，可以同时检测到AAV载体DNA的存在及其在肝脏中的分布。上图为通过eGFP正义探针进行AAV载体DNA检测，下图则结合了eGFP反义探针检测AAV载体DNA和mRNA的表达。该实验通过高分辨率的成像技术，提供了AAV载体在肝脏细胞中的精确定位和表达情况。
AAV载体的转导效率：正常与脂肪肝肝脏的对比
不同AAV载体在正常肝脏中的表现：AAV8的优势
在正常肝脏中，研究结果表明，AAV8载体的转导效率显著高于其他常用的AAV载体，如AAV5、AAV6和AAV-LK03。通过常温体外灌注（NMP）技术，研究人员发现，在正常人类肝脏中，AAV8能够高效转导肝细胞，尤其是肝脏的门脉区（periportal zone）。这一发现得到了单细胞RNA测序（scRNA-seq）和流式细胞术的进一步验证，AAV8的转导效率在肝细胞中几乎达到最高水平。免疫荧光染色显示，AAV8载体能够准确地将标记基因导入肝脏细胞，并成功产生转基因蛋白。实验数据还表明，AAV8在正常肝脏中的转导不仅限于肝细胞，还在少量内皮细胞和巨噬细胞中显示出转导特性，这使得AAV8成为一种多细胞类型转导的理想载体。
这一结果进一步证明了AAV8在肝脏基因治疗中的广泛适应性和高效性。在对比其他AAV载体时，AAV8的优势尤为突出，它在正常肝脏中展现出持续且稳定的基因表达，并能够较好地维持治疗效果。因此，AAV8在临床肝脏基因治疗中被广泛应用，特别是在一些遗传性血液病如血友病中的治疗中，已取得显著疗效。
脂肪肝肝脏中AAV载体的表现差异：AAV5的转导特性
然而，当脂肪肝肝脏进入实验时，AAV载体的表现出现了明显的变化。在脂肪肝状态下，AAV5载体表现出较强的转导优势，特别是在肝脏的中心区（pericentral zone）。相比于AAV8，AAV5在脂肪肝肝脏中的转导效率显著提高。研究显示，AAV5在脂肪肝肝脏中的转导效率明显高于其他AAV载体，这可能与脂肪肝改变了肝脏的微环境和代谢功能密切相关。脂肪肝状态下，肝脏的血流和细胞膜特性发生变化，这可能为AAV5载体的转导提供了有利条件。
通过对脂肪肝肝脏的单细胞RNA测序分析，研究人员发现，AAV5载体在脂肪肝肝脏中的转导效率不仅仅局限于肝细胞，还影响了部分非肝细胞，如肝脏内皮细胞和巨噬细胞。这一结果进一步证明了脂肪肝对AAV5载体的促进作用，使得AAV5成为治疗脂肪肝相关疾病的潜在载体。与AAV8不同，AAV5在脂肪肝中的优势使其成为一个值得关注的基因治疗选择，尤其是在治疗脂肪性肝炎（NASH）或脂肪肝相关疾病时。
脂肪肝如何改变AAV载体的转导模式和效率
脂肪肝不仅改变了AAV载体的转导效率，还影响了其转导模式。在正常肝脏中，AAV8表现出对门脉区肝细胞的优先转导，而在脂肪肝肝脏中，这一模式发生了显著变化。脂肪肝状态下，AAV8的转导效率明显降低，尤其是在肝脏的门脉区，转导主要集中在中心区。这一变化可能与脂肪肝引发的肝脏微环境改变密切相关，脂肪堆积、氧化应激以及炎症反应可能会影响AAV载体与肝细胞的结合与内吞作用。
另外，脂肪肝还通过影响AAV载体与肝脏不同区域之间的相互作用，导致AAV载体的转导模式发生变化。在脂肪肝肝脏中，AAV5显示出优先转导中心区肝细胞的特性，而AAV8则在脂肪肝状态下表现出不稳定的转导效果。通过ddPCR和免疫组织化学（ISH）分析，研究人员进一步证实了脂肪肝状态下的AAV载体转导效率变化，并揭示了AAV载体转导区域的差异。
这些结果突显了脂肪肝对AAV载体转导模式的影响，提示我们在设计肝脏基因治疗时，必须考虑肝脏的病理状态。例如，针对脂肪肝患者，选择AAV5作为治疗载体可能会取得更好的效果，特别是在提高转导效率和特异性方面。
基因治疗的新时代
在过去的几十年里，基因治疗作为一种创新的治疗手段，在肝脏疾病的治疗中展现了巨大的潜力，特别是在血友病等遗传性疾病的临床应用中取得了显著成果。随着技术的不断进步，尤其是AAV载体（腺相关病毒载体）的不断优化，肝脏基因治疗的效果和应用前景有了质的飞跃。通过精准选择最适合的AAV载体，结合肝脏的病理状态，研究人员已能为不同患者量身定制治疗方案，从而极大提高治疗的成功率和长期效果。
该研究揭示了脂肪肝等肝脏疾病对AAV载体转导效率的影响，突显了个性化治疗在基因治疗中的关键作用。特别是在脂肪肝患者中，研究发现，选择不同的AAV载体，如AAV5，能够显著提高治疗效果，因为它能够高效转导肝脏的中心区，而AAV8则在这种病理状态下的转导效率较低。这一发现不仅为脂肪肝患者的基因治疗提供了新的视角，也为其他肝脏疾病患者的治疗提供了重要的理论依据。AAV载体的优化和个性化选择，能够让基因治疗不仅更加精准，还能最大化疗效，降低治疗中的风险，带来更加持久和稳定的效果。
未来，随着AAV载体技术和其他基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）的不断优化，基因治疗将成为越来越多肝脏疾病患者的治疗选择。无论是脂肪肝、乙型肝炎，还是肝纤维化等慢性肝脏疾病，都有可能在基因治疗的帮助下得到有效治疗。通过个性化和精准化的治疗策略，基因治疗有望在未来彻底改变肝脏疾病的治疗格局，为患者带来新的生命希望。
参考文献
Kim JJ, Kurial SNT, Choksi PK, Nunez M, Lunow-Luke T, Bartel J, Driscoll J, Her CL, Dhillon S, Yue W, Murti A, Mao T, Ramos JN, Tiyaboonchai A, Grompe M, Mattis AN, Syed SM, Wang BM, Maher JJ, Roll GR, Willenbring H. AAV capsid prioritization in normal and steatotic human livers maintained by machine perfusion. Nat Biotechnol. 2025 Jan 29. doi: 10.1038/s41587-024-02523-6. Epub ahead of print. PMID: 39881029.
责编|探索君
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