摘要：当我们想要研究一个基因的功能时，首先想到的是过表达、敲除或沉默。对于烟草、水稻、玉米等稳定遗传转化体系相对成熟的物种来说，创制稳转植株是研究基因功能的不二之选。如果研究的物种并无稳转体系，除了借助模式植物进行稳定转化外，瞬时转化本物种进行功能研究也是一种行之有
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当我们想要研究一个基因的功能时，首先想到的是过表达、敲除或沉默。对于烟草、水稻、玉米等稳定遗传转化体系相对成熟的物种来说，创制稳转植株是研究基因功能的不二之选。如果研究的物种并无稳转体系，除了借助模式植物进行稳定转化外，瞬时转化本物种进行功能研究也是一种行之有效的方法。
在瞬时转化中，原生质体、愈伤组织、毛状根都是常用的受体材料。然而，目前原生质体的制备也受限于物种，常见且制备稳定的仅有水稻、玉米、拟南芥等。由于植物原生质体制备的条件苛刻需要反复调整，因此摸索一个新物种的原生质体制备体系耗时耗力。此外，用于制备原生质体的细胞壁裂解酶也相对昂贵；愈伤组织的诱导往往会同时受到激素、外界环境、细胞分化能力等多种因素影响，导致愈伤诱导困难，因此其应用相对受限。
相比之下，利用毛状根作为受体材料进行基因功能研究是一个较为不错的选择，其诱导体系较为容易建立，转化也较为稳定。下面跟着小远一起来看看吧！
一、背景介绍
毛状根是指由发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）侵染植物组织、细胞所产生的一种高度分支的不定根，是植物的一种病理现象。发根农杆菌作为诱导毛状根产生的必备条件，其菌株种类是决定毛状根诱导成功的关键条件。不同的发根农杆菌具有不同的Ri质粒，根据Ri质粒诱导植物产生碱的类型可将农杆菌分为：农杆碱型（如A4、A7、ArQual、C58C1、MSU440、ATCC15834、LBA9402、R1000、R1200等）、甘露碱型（如pRi8196、pRiTR7等）、黄瓜碱型（如K599）和异黄瓜碱型（如pRi1724、A13等）(Bahramnejad et al., 2019)。其中农杆碱型和黄瓜碱型的宿主种类多样、诱导效率较高，因此广泛应用于毛状根的诱导。相比于单子叶植物，双子叶植物的细胞木质化程度较低，在受到损伤时更容易分泌酚类和糖类化合物，损伤部位附近的细胞也更容易形成感受态细胞，因此双子叶植物更容易诱导出毛状根(Zhu et al., 2024)。然而，部分单子叶植物的毛状根诱导体系也被建立，如大蒜(Phuong et al., 2023)、谷子(Wan et al., 2023)等。目前已经有50个被子植物科和150个属的400多种植物的毛状根体系建立，其中大部分植物集中在菊科、十字花科、豆科、伞形科石竹科、旋花科、蓼科、茄科、百合科和蔷薇科中(Rogowska A and Szakiel A, 2021; Phuong et al., 2023)。
二、毛状根诱导机制
发根农杆菌的的Ri质粒具有T-DNA转移区和Vir致病区。T-DNA主要功能是转化时进入植物细胞并插入宿主植物基因组中，表达决定毛状根生长的基因；Vir致病区含有VirA-VirG 7种致病蛋白，其主要功能是负责T-DNA的转运。
发根农杆菌侵染植物细胞时会诱导植物中与酚类、糖类合成相关基因chvA、chvB 及pscA 的表达，从而吸引发根农杆菌定殖。同时发根农杆菌体内的VirA蛋白感知植物分泌物促使VirG蛋白磷酸化，磷酸化的VirG蛋白与vir 调控序列或位于VIR 基因簇启动子序列中的vir box结合，最终激活致病蛋白VirB、VirC、VirD、VirE、VirF的表达。其中VirD蛋白负责将单链T-DNA加工成不成熟的T-DNA复合物；VirC蛋白与位于T-DNA边界附近的“过载序列”结合以增加T-DNA链的数量；VirD蛋白与VirB蛋白通过IV型分泌系统T4SS将T-DNA和其他致病蛋白转运到植物细胞中；VirE蛋白包裹T-DNA形成成熟的T-DNA复合物，在植物LRR受体、磷酸化的VIPs蛋白和植物进口蛋白α的共同作用下，成熟的T-DNA复合物进入植物细胞核；VirF蛋白与植物泛素-蛋白酶体复合物共同作用去除成熟T-DNA复合物上的细菌致病蛋白和宿主蛋白，以实现T-DNA在植物基因组中的高效整合；最终T-DNA诱导植物组织分泌大量的生长素和细胞分裂素产生大量毛状根（图1）。
图1 发根农杆菌诱导植物毛状根的主要步骤示意图(Zhu et al., 2024)。①：农杆菌对植物细胞的识别和附着；②：VirA/VirG双组分信号转导系统感知特定植物信号并刺激VirG磷酸化；③磷酸化的VirG诱导其他Vir蛋白的产生；④：T-DNA单链由VirD1/VirD2蛋白产生，并与VirD2结合形成未成熟T-DNA复合体；⑤：未成熟的T-DNA复合体通过T4SS进入植物细胞，并与进入的VirE蛋白结合形成成熟的T-DNA复合体；⑥：农杆菌鞭毛蛋白触发MAPK级联，导致VIP蛋白磷酸化；⑦：成熟的T-DNA复合物、磷酸化的VIP蛋白和植物的进口蛋白α形成复合物，并进入细胞核；⑧：VirF蛋白和植物的泛素/蛋白酶体系统剥离T-DNA的伴随蛋白；⑨：T-DNA整合到植物基因组中；⑩：由转化组织产生的细胞分裂素和生长素诱导肿瘤或毛根的形成。
三、毛状根在植物基因功能研究中的应用
由于毛状根具有生长速度快、周期短、遗传稳定等优点，目前已经被广泛应用于植物的基因功能研究中。
3.1
验证基因编辑效率
尽管目前CRISPR Cas系列编辑工具在植物基因编辑领域展现出了极大的优势与潜力，但是能否获得基因编辑植株往往会受到sgRNA的特异性、驱动Cas蛋白启动子等多种因素的影响，且获得基因编辑植株的时间往往较长，因此为了保证获得基因编辑植株的概率，在进行稳定遗传转化之前最好先评估载体的编辑效率。
2023年10月比利时布鲁塞尔自由大学Geert Angenon课题组在Frontiers in Plant Science杂志上发表了一篇题为“Fine-tuning CRISPR/Cas9 gene editing in common bean (Phaseolus vulgaris L.) using a hairy root transformation system and in silico prediction models”的研究论文。在该研究论文中，作者一共设计了9个sgRNA，靶向3个基因（PvRS1、PvRS2、PvSS），分别将其构建在由35S启动子驱动Cas9 表达的pMR394-GFP编辑载体上和由Ubi启动子驱动Cas9 表达的pMR356-GFP编辑载体上。通过发根农杆菌KN599接种大豆切断的胚根，采用瞬时转化毛状根的方法，评估了载体的编辑效率。结果表明对于PvRS1，sgRNA2的平均INDEL和KO效率最高，在pMR356-GFP载体上的编辑效率分别为75.1%和55.3%，在pMR394-GFP上的编辑效率分别为84.8%和73.8%。对于PvRS2，sgRNA1和sgRNA3在pMR356-GFP获得最高的编辑效率，平均INDEL效率为77.6%，KO效率范围为65.4至68.7%。对于PvSS，sgRNA3在pMR356-GFP获得最高的编辑效率，平均INDEL效率为84.7%，平均KO效率为65.5%（图2）。此外作者同时采用了生信分析工具分析了sgRNA的效率，两种方法结合为后续开展基因编辑提供了参考依据。
图2 pMR356-GFP和pMR394-GFP中9种不同sgRNAs的突变检测和编辑效率总结(de Koning R et al., 2023)。（A）由sgRNA3（pMR356-GFP）编辑的靶向PvRS1的一个毛状根结果展示，包括观察到的突变类型；（B）PvRS1、PvRS2 和PvSS 中诱导插入和敲除突变的平均sgRNA效率总结。
3.2
创制转基因株系
基于根癌农杆菌介导的遗传转化依旧是目前的主流方法，但是其往往需要经过一个长期的组织培养阶段，且并不能适用于所有物种。在此背景下，通过诱导毛状根的方法创制转基因株系为植物遗传转化提供了新的思路和方法，主要方法包括：CDB系统、一步诱导法和组织培养法（图3）。关于利用毛状根创制转基因株系的文章小远在“植物高效遗传转化方法，请查收！”中有所介绍，感兴趣的小伙伴可以点击阅读。
图3 毛状根在植物遗传转化中的应用(Zhu et al., 2024)。（A）对于具有吸根能力的植株，在非无菌条件下，采用切浸萌发（CDB）系统诱导毛状根形成转基因植株；（B）在无菌条件下的培养基中可以通过两种方式获得转基因植株。通过向培养基中添加激素，毛状根可以一步诱导成整株植物，也可以通过将毛状根诱导成愈伤组织，再诱导转基因植株产生。
3.3
验证基因功能
表型鉴定
前面已经讲到毛状根可以用于诱导转基因株系产生，那么自然也可以用来研究基因表型。2024年12月，安徽农业大学方从平课题组在Horticultural Plant Journal杂志上发表了一篇题为“Establishment of an in vivo transgenic hairy root system in strawberry for verifying the nitrate-transport activity of FaNRT1.1”的研究论文。在该研究论文中作者开发了红颜草莓的转基因毛状根诱导体系，基于该体系分别得到了FaNRT1.1 过表达和沉默的转基因毛状根。随后作者通过qRT-PCR分析了与硝酸盐转运相关基因（FaNRT1.1、FaNRT1.2、FaNIA、FaNIR、FaGLN、FaGLU 和FaGDH）的表达水平，同时分析了15N-硝酸盐在毛状根中的积累量。结果表明，在FaNRT1.1 过表达的毛状根中，硝酸盐相关转运基因的表达水平均增加，且15N-硝酸盐硝酸盐显著积累（图4）；在FaNRT1.1 沉默的毛状根中硝酸盐相关转运基因的表达水平均下降，且15N-硝酸盐硝酸积累量下降（图5）。
图4 FaNRT1.1 在草莓转基因毛状根中过表达增强了毛状根对硝酸盐的吸收(Hao et al., 2024)。（A）用EV1（pCAMBIA1302）和OE（pCAMBIA1302-FaNRT1.1）转化的毛状根的生长表型；（B-H）EV1、OE1、OE2和OE3毛状根中参与硝酸盐利用的基因的表达分析；（I-J）毛状根和叶片的氮积累效率。
图5 FaNRT1.1 在草莓转基因毛状根中的沉默减少了毛状根对硝酸盐的吸收(Hao et al., 2024)。（A）用EV2（pHellsgate2）和IE（pHellsgate2-FaNRT1.1）转化的毛状根的生长表型；（B-H）EV2、IE1和IE2毛状根中参与硝酸盐利用的基因的表达分析；（I-J）毛状根和叶片的氮积累效率。
蛋白定位及互作验证
2019年9月，北京林业大学付玉杰课题组在Plant Biotechnology Journal杂志上发表了一篇题为“Development of an efficient root transgenic system for pigeon pea and its application to other important economically plants”的研究论文。在该研究论文中，作者首先在木豆中建立了毛状根诱导体系，并且将其应用到红花、秋葵、苹果、菘蓝等果树和药用植物。随后作者为了证明转基因毛状根还可以应用于研究基因的分子调控机制，首先通过Western blot实验检测了CcCIPK1、CcCIPK14、CcCBL1和CcCBL2蛋白在转基因毛状根的表达情况，随后在毛状根中进行了BiFC实验，结果表明CIPK14与CBL1/CBL2存在相互作用。随后利用Y2H实验证实了BiFC实验的结果（图6）。
图6 使用毛状根转基因系统的BiFC实验(Meng et al., 2019)。（a）将CcCIPK14和CcCBL1/CcCBL2分别构建到pSPYNE或 pSPYCE载体中，以CcCIPK6和CcCBL1、CcCIPK14-YFPc和YFPn、YFPc和CcCBL1-YFPn对作为阴性对照。使用Myc或HA抗体检测融合蛋白；（b）Y2H验证。
除上述案列外，转基因毛状根还可以用于转录组学、蛋白质组学、代谢组学方面的研究，寻找不同条件下的差异表达基因、差异表达蛋白和差异表达代谢物。基于组学的结果我们不仅可以辅助验证基因的功能还可以筛选得到与目的基因紧密相关的基因，从而更完整地解析基因功能。
四、其它方面的应用
4.1
合成次生代谢物
植物在不同生产发育过程中产生的各种不同的次生代谢物不仅广泛参与植物应对生物或非生物胁迫，还可以用于生产医药试剂、食品加工等。但植物自身产生的次生代谢物往往含量低、提取纯化难度高且植物栽培生殖的周期长，因此利用源植物合成的次生代谢物往往难以达到工业生产的要求。毛状根具备强大且稳定的次生代谢物合成能力，通过基因调控以及与微生物的协同作用，能够大量合成如生物碱、黄酮类等具有高药用价值的化合物，多种植物毛状根诱导体系的建立为次生代谢物的合成提供了新的方向。
2024年8月，西北农林科技大学麻鹏达课题组在Metabolic engineering杂志上发表了一篇题为“Metabolic engineering of artificially modified transcription factor SmMYB36-VP16 for high-level production of tanshinones and phenolic acids”的研究论文。在该研究论文中，作者对转录因子SmMYB36和转录激活子VP16进行联合改造，获得了人工修饰的新型转录因子SmMYB36-VP16，实现了丹参酮和酚酸的高效生产（图7A）。结合诱导子双筛选技术筛选出了最佳诱导子添加时间和浓度，在SmMYB36-VP16 转基因丹参毛状根中丹参酮含量达6.44mg/g干重，是未处理对照的6.08倍，酚酸含量达141.03mg/g干重，是未处理对照的5.05倍（图7B-D）。
图7 SmMYB36-VP16促进了转基根丹参酮和酚酸的积累(Jia et al., 2024)。（A）转基因毛状根中丹参酮和酚酸含量；（B）不同添加时间对SmMYB36-VP16转基因毛状根表型的影响；（C）不同添加时间对SmMYB36-VP16转基因毛状根代谢产物积累的影响；（D）在最佳添加时间下分别添加5种最优浓度的激发子的结果比较。总酚酸（TPA）等于丹酚酸B（SalB）和迷迭香酸（RA）之和，总丹参酮（TTA）等于二氢丹参酮（DTI）、隐丹参酮（CT）、丹参酮I（TAI）和丹参酮IIA（TAIIA）之和。
4.2
环境修复
“退耕还林”和“植树造林”这些常见的字眼从本质上来说都是利用植物自身的修复能力来改善自然环境。植物修复指的是利用植物吸收土壤、水分和空气中的污染物，并将其转化为无毒化合物的过程。毛状根对重金属污染土壤有着独特的吸附与转化本领，其细密的根表面积以及特殊的离子交换机制，可有效富集土壤中的重金属离子，降低土壤毒性；同时，对于有机污染物，毛状根分泌的特定酶类能将复杂有机物逐步降解。
2023年1月，北京交通大学宴琼/程曦宇课题组在International journal of phytoremediation杂志上发表了一篇题为“Establishment of hairy root system of transgenic IRT1 brassica campestris L. and preliminary study of its effect on cadmium enrichment”的研究论文。在该研究论文中，作者利用发根农杆菌ATCC15834建立了油菜的转基因毛状根诱导体系，并且创制了IRT1过表达油菜毛状根，随后分析了不同Cd浓度下过表达ITR1毛状根的生物量、Cd的富集效率以及ITR1的表达量。结果表明，随着时间和Cd浓度的增加，野生型毛状根和IRT1过表达毛状根的鲜重和干重均呈下降趋势，14d时，野生型毛状根的干重和鲜重下降趋势更为明显，转基因毛状根中Cd富集效率提高了13.73%（图8）。综上，过表达IRT1毛状根比野生型毛状根具有更好的Cd富集特性和富集效率，可用于Cd污染土壤的修复。
图8 过表达IRT1毛状根对不同浓度Cd的耐受(Liu et al., 2023)。（A、B）不同浓度Cd对油菜毛状根鲜重（A）、干重（B）的影响；（C）以及油菜毛状根Cd富集效率分析。I：过表达IRT1毛状根；W：野生型毛状根。
小远叨叨
小远遇到过很多客户研究的物种没有高效的稳定遗传转化体系，很多实验只能借助模式植物来完成。然而，不同物种之间存在一定差异，尽管基因功能可能类似但还是存在细微差别。本文从植物基因功能研究、合成次生代谢物、环境修复三个方面给大家介绍了毛状根的应用，希望可以给大家提供新的研究思路。诚然，毛状根也有一定的缺点，在宏观表型层面上，它只适用于解析基因在根系发育中的功能，但是如果可以通过毛状根创制转基因植株，那么该问题也就迎刃而解了。目前，开发毛状根诱导体系相对简单，伯远生物已有大豆、马铃薯、辣椒、苜蓿、棉花的毛状根诱导体系，其他物种均可尝试开发哦~
References：
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de Koning R, Daryanavard H, Garmyn J, et al. Fine-tuning CRISPR/Cas9 gene editing in common bean (Phaseolus vulgaris L.) using a hairy root transformation system and in silico prediction models[J]. Frontiers in Plant Science, 2023, 14: 1233418.
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Liu X, Li W, Wang M, et al. Establishment of hairy root system of transgenic IRT1 brassica campestris L. and preliminary study of its effect on cadmium enrichment[J]. International Journal of Phytoremediation, 2023, 25(11): 1455-1462.
来源：伯远生物