《Cell》综述：人类微生物组研究中的单细胞方法

摘要：微生物单细胞测序技术作为近年来快速发展的前沿科技，凭借其独特优势，成功跻身2025年《Nature》杂志评选出的七大关注技术之列。该技术一举突破了传统微生物组学研究的诸多局限，成功实现了在单细胞层面解析微生物群落的组成、功能和相互作用，精准解析群落的异质性和未

微生物单细胞测序技术作为近年来快速发展的前沿科技，凭借其独特优势，成功跻身2025年《Nature》杂志评选出的七大关注技术之列。该技术一举突破了传统微生物组学研究的诸多局限，成功实现了在单细胞层面解析微生物群落的组成、功能和相互作用，精准解析群落的异质性和未培养微生物的功能，为微生物学研究带来革命性突破。

今天，小编带大家一起回顾一篇发表在《Cell》杂志上的综述文章。

微生物培养和宏组学分析技术显著推进了我们对人类微生物群落的分类和功能变异及其对宿主过程影响的理解。接下来，理解低丰度和不常见细菌的作用以及研究复杂微生物生态系统中单个细胞行为背后的机制将进一步提高分辨率。为此，单细胞技术正在迅速发展，用于分离、培养和表征复杂群落中单个微生物的基因组和转录组。本文讨论了这些单细胞技术如何为人类微生物群的生物学和行为提供独特见解。

引言

多年来，人类微生物群领域通过技术创新不断发展，逐渐提高了研究的复杂性、规模和分辨率，同时揭示了宿主相关微生物群的结构、多样性和功能。在过去几十年中，改进的培养方法导致了包含数千种人类来源菌株的培养物集合，用于基因组和代谢特征分析以及体外机制研究微生物-微生物和微生物-宿主相互作用。同时，不依赖于培养的扩增子或散弹宏基因组测序方法在阐明微生物群变异及其与宿主生理和健康的联系方面显示出强大力量。在宏基因组学的推动下，其他“宏组学”技术如宏转录组学、宏蛋白质组学或宏代谢组学已被用于阐明人类微生物群的功能性。

尽管这些技术已成为当代人类微生物群研究的标准，但它们并非没有局限性和挑战。例如，低丰度类群在实验室条件下难以分离或培养，并且在宏基因组样本中其基因组代表性不足。据估计，在人类肠道微生物群中广泛研究的70%以上已编目细菌仍缺乏培养代表。此外，“组学”技术无法区分和验证单个微生物的功能。即使在单一菌株内，微生物细胞群体也可能高度异质，克隆细菌种群在基因表达方面显示出显著异质性，这对于特定条件下的菌株生存至关重要，例如抗生素治疗期间的细菌持留菌。为了研究这种微多样性，传统的“宏组学”方法显然存在不足。为了克服这些挑战，下一波创新越来越关注单细胞水平。事实上，在今天的微生物群研究工作流程的每一步中，单细胞分析都已被引入并不断优化以解决新的生物学问题。

在本文中，我们介绍了用于分离、培养和基因组及转录组分析的最先进的单细胞方法，这些方法为微生物群研究的各个方面做出了贡献。尽管我们主要关注人类微生物群的研究，但我们也承认在其他领域如动物或环境微生物群中的工作，特别是在方法开发方面。最后，我们还强调了人类微生物群样本面临的特定挑战，需要克服这些挑战以促进该领域的单细胞技术。

单细胞方法在细菌分离、培养和筛选中的应用

与琼脂稀释涂布等传统方法相比，最近的单细胞技术进展在微生物群落的分离过程中在分类广度和通量方面实现了革命性变化。将样本的微生物群落物理分离成空间上分离的细胞克服了微生物分离中的一个主要问题，即不同个体生长速率以及营养和空间竞争不可避免地促进快速生长生物体的过度生长。因此，单细胞方法有可能恢复比传统方法中通常分离的“常见嫌疑人”更高的物种丰富度。

然而，由于一些单细胞在与其支持物种（例如，交叉喂养物种）分离后可能无法生长，因此建议与批量方法结合使用。

图1 | 人类微生物群研究中的单细胞方法

单细胞方法‌：微生物细胞需要在液滴或微孔板中分隔开。或者，细胞本身可通过渗透其细胞壁来对细胞内的核酸进行条形码标记或标记，作为单个隔室。单细胞随后可以进行培养、筛选以选择特定特征，以及测序或基于显微镜的空间分析。

最近在人类微生物群单细胞分离和培养中的技术创新

主要采取两种主要方法：（1）通过基于流的液滴微流体将来自水相的自由细胞封装在单个或双水包油乳液中；（2）在微型化的物理微孔或微阀阵列中将单个细胞空间限制分隔开。

液滴微流体

液滴微流体依赖于两相微通道流体学，将单个细胞或分子捕获在水性单分散球形颗粒中，这些颗粒由连续的生物相容性油相循环。由于其在通量、并行化、物理化学标准化和动态过程控制方面的潜力，这项技术因在分子和细胞生物学实验室中的成功实施而越来越受到认可，成为单细胞微生物群分离和培养工作流程的关键组成部分。

由于大多数被动细胞捕获过程受泊松统计支配，因此只有一部分生成的微液滴将有效地包含单个细胞，背景群体为空微液滴和包含两个或多个细胞的液滴。通常通过优化样品入口稀释度来最大化单细胞封装率，但更高级的修改（如实时成像）可用于通过机器学习算法选择性地对仅包含单个细胞的液滴进行排序。

在人类身体的厌氧生态系统中，如肠道、阴道或龈下间隙微生物群，用于分离、培养和测定单个微生物细胞的液滴微流体面临额外挑战，即样本处理、生长监测和液滴排序需要在无氧条件下进行（例如，80%N2/10%H2/10%CO2；表1）。由于许多包含液滴发生器与流式细胞仪和/或分选装置相结合的最新微流体管线难以集成到标准厌氧工作站中而不损害操作员或孵育空间，因此已研究了替代的生长监测方法。

微阵列或基于分隔的技术

与液滴微流体相比，基于分隔的工作流程的主要优势是它们提供更大的培养室，以便将单个细胞扩展到更大体积中的高密度微菌落。这不仅可以减少无法生长的分离物损失，还可能允许更长的孵育时间并提高生物读数的敏感性。此外，与液滴相比，从离散微隔室中收获选定的微菌落通常更直接。尽管许多早期微分隔装置（如微培养皿、iChip和SlipChip）可以在厌氧工作站中轻松操作，但很少有装置在人类相关厌氧细菌上得到验证。

近年来，单细胞工作流程从自制的实验室装置发展到更易于使用的商业台式设备。在这方面，Prospector系统（General Automation Lab Technologies）是一种自动化的基于阵列的分隔培养平台，它在一个适合中型厌氧柜的仪器中集成了光学生长监测、选择和微培养物的转移。在一项初步研究中，使用该系统从六个人类粪便样本中分离出的约45个物种中，有一半被认为是基于配对16S rDNA宏基因组数据分析的低丰度（

单细胞基因组分析在人类微生物群中的应用

单细胞技术用于复杂微生物群样本的基因组分析可以进一步深入了解其系统发育、生态和进化。这些技术不仅被用于扩展和改进测序的人类微生物目录，还被用于解决单细胞水平的微生物相互作用并绘制单个细菌在其自然生态系统中的空间定位图。

单细胞基因组测序扩展微生物生命之树

在散弹宏基因组测序广泛使用之前，出现了从单个微生物细胞中获得单扩增基因组（SAG）的第一波方法。这些方法主要是为了帮助阐明“微生物暗物质”，即通过16S rDNA调查鉴定的大量微生物分类群，但缺乏培养代表或高质量参考基因组。第一个人类来源的SAG针对的是口腔腔中的候选门TM7（后来重命名为Saccharibacteria）成员。

随着散弹宏基因组学技术的扩展和计算组装方法的发展，从人类微生物群中获得的宏基因组组装基因组（MAG）的数量和质量在过去几年中显著增加。尽管从散弹宏基因组学中恢复的MAG的质量不断提高，但单细胞基因组测序仍然扩展了微生物目录，改进了组装，并为来自单个细胞的完整基因组序列提供了“真实”生物学验证和/或骨架。例如，几项研究已将单细胞基因组测序与散弹宏基因组学相结合，用于比较这两种技术或将它们集成以获得更好的组装。

微生物基因组分析在单细胞分辨率下提供人类微生物生态和进化的见解

单细胞微生物基因组测序还可以提供有关人类微生物群生态和进化的见解，如移动遗传元件的传播。此外，单细胞基因组学还被用于研究噬菌体-宿主相互作用。通过结合“病毒标记”的靶向策略和单细胞基因组测序，研究人员发现了肠道物种中的病毒-宿主配对。

单细胞转录组学揭示功能异质性

上述技术提高了我们识别和基因组编目人类微生物群成员的能力。然而，还需要其他方法来实现对宿主相关微生物的完全功能表征，因为等基因细菌群体之间的功能异质性是众所周知的。单细胞转录组学的出现极大地提高了我们表征这种异质性在真核细胞群体中机制和模式的能力，并且这些方法的快速演变终于开始被利用，揭示了原核生物中单个基因表达模式。

使用单细胞RNA-seq测量内在功能异质性

最近，基于组合索引的原位技术解决了一些需要将细菌分隔在皮升体积试剂中进行单个细胞处理的技术的挑战。特别是，在细胞裂解之前在cDNA构建物上添加分子条形码的能力消除了在液滴或孔中物理分隔的需要，因为细胞本身充当单个隔室，从而促进了对样品的多步处理。

基于FISH的技术解决细菌细胞群体中的空间功能异质性

尽管最近努力在单细胞水平上绘制分类生物地理学图，但解决微生物群中基因表达空间异质性的分辨率目前尚缺乏。然而，与scRNA-seq类似，组合索引的进步也最近扩展到基于FISH的技术，增加了潜在基因靶标的数量到成百上千个。

双scRNA-seq揭示宿主-微生物相互作用机制

双scRNA-seq技术利用现有的真核生物方法来捕获和测序细菌暴露宿主细胞中的宿主和微生物mRNA，已显示出在阐明宿主-微生物相互作用方面的巨大潜力。在单细胞双测序（scDual-seq）中，第一种同时在单细胞水平上对宿主和细菌RNA进行测序的方法，通过用随机六聚体引物替换聚(A)引物来捕获宿主和细菌mRNA。

从宿主scRNA-seq数据中挖掘微生物RNA揭示隐藏信息

尽管许多研究专注于高效捕获宿主和微生物mRNA，但最近的研究表明，在现有的宿主scRNA-seq数据集中可能隐藏着大量微生物转录信息。几个小组最近开发了从宿主scRNA-seq数据中挖掘微生物序列的方法，以阐明一系列宿主-微生物群相互作用。

结论与展望

人类相关微生物群落的巨大异质性早已被认识，但直到最近，单细胞生物学领域的技术发展才揭示了这些生态系统中个体变异性。然而，我们目前处于这些单细胞技术应用的不同发展阶段。尽管单细胞细菌分离和培养以及单细胞DNA测序已成功应用于环境和人类相关微生物群，甚至存在一些商业平台，但微生物单细胞转录组学的研究努力仍主要集中在培养菌株上，因为复杂群落中仍有许多挑战需要解决，如细胞壁结构的多样性、mRNA丰度低或mRNA稳定性差。尽管存在这些限制，但已证明在一定程度上，即使在宿主相关组织中，细菌序列也可以通过单细胞方法捕获。这种可能性将为开发联合宿主-微生物群单细胞基因组和转录组学方法打开大门，这些方法将提供解开复杂宿主-微生物群相互作用所需的技术基础。

这些微生物群单细胞技术的发展不应是最终目标，而应被视为改进我们对人类微生物群当前理解的工具：识别和表征低丰度成员，并探索微生物群甚至在菌株内的内在功能变异性，以评估它们如何影响生态系统水平行为。为此，我们应努力使这些工具广泛可供微生物群研究人员使用，通过标准化当前技术并使其负担得起且可并行化以获得大样本量。只有这样，我们才能探索人类微生物群中微生物菌株和功能的巨大多样性，以及它们与宿主相互作用的机制，从而影响健康和福祉，一次一个细胞。

参与活动

为破译微生物 “暗物质” 密码，欧易生物携手墨卓生物联合发起“微世界大作为|微生物单细胞探索者支持计划”，以单细胞技术突破传统研究局限，推动微生物奥秘解析。

活动福利

微生物单细胞基因组

微生物单细胞转录组

最高2万元服务支持

单个项目

最高5万元服务支持

单个项目

参与方式

活动规则

本次计划将从报名项目中筛选出25个优质项目，获得服务支持，开启微生物单细胞研究新征程。