Cell丨复旦大学研究团队设计高效双功能抗病毒候选药物

摘要：2025年1月30日，复旦大学上海医学院陆路研究员、孙蕾研究员、姜世勃教授团队合作在《细胞》（Cell）杂志以Research Article的形式，在线发表了题为“Early fusion intermediate of ACE2-using coronav

转自：上观新闻

2025年1月30日，复旦大学上海医学院陆路研究员、孙蕾研究员、姜世勃教授团队合作在《细胞》（Cell）杂志以Research Article的形式，在线发表了题为“Early fusion intermediate of ACE2-using coronavirus spike acting as antiviral target”的研究论文。该研究发现了ACE2受体诱导的冠状病毒刺突蛋白早期融合中间态构象（E-FIC），并针对该中间态构象设计了高效、广谱、兼具失活病毒和抑制病毒感染的双功能抗冠状病毒候选药物。

在包膜病毒入侵宿主细胞的过程中，一些病毒能够借助其表面蛋白介导其包膜与宿主细胞膜融合，进而将遗传物质注入细胞开启感染进程。膜融合是病毒建立感染的关键环节之一。

在冠状病毒家族中，这一环节由病毒表面刺突（Spike，S）蛋白介导完成。以新冠病毒为例，S1亚基产生构象变化，进而暴露出其受体结合域（RBD），并通过该结构域结合细胞受体。S1亚基与细胞受体的结合会触发S1亚基解离，当S2亚基中蛋白酶水解位点（S2’）被宿主蛋白酶切割后，S2亚基中的融膜肽（FP）弹出并插入宿主细胞膜，以此启动膜融合。最终，HR1形成三螺旋束，HR2则折叠成螺旋状，并与HR1三螺旋紧密结合，形成稳定的六螺旋束，促使病毒包膜与宿主细胞膜完成融合。

近年来，众多研究团队成功揭示了SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2以及其他一些冠状病毒S蛋白的RBD与受体结合的复合物构象，以及S蛋白三聚体与受体结合的融合前构象。姜世勃、陆路等研究团队也发现了MERS-CoV（Nature Communications 2014）、SARS-CoV-2（Cell Research 2020）等S蛋白HR1/HR2形成六螺旋的融合后构象。

但目前仍有一个关键问题尚未明确——刺突蛋白从融合前状态转变为融合后状态时，究竟经历了怎样的构象变化。虽然已有研究者发现新冠病毒S2亚基中间态构象，但是对于早期的融合中间态，特别是介于受体结合和S1亚基脱落之间的S蛋白构象是否存在，及其变构细节等还一直处于认知盲区。

融膜肽如何跨越病毒包膜和细胞膜之间的“长途”距离，有效插入细胞膜？为何S2’位点切割对于新冠病毒诱导的膜融合起着至关重要的作用？短暂暴露的S蛋白融合中间态构象是否存在新的广谱抗病毒药物靶点以及能否针对该类靶点设计新型药物？在膜融合起始阶段，出现了一系列亟待解答的重要科学问题，并成为科学家们一直以来重点关注的焦点。

传统观点通常认为，冠状病毒S1亚基在结合受体并脱落后，会触发S2亚基构象重排，进而暴露HR1结构域。因此，研究团队对新冠病毒S蛋白是否存在介于ACE2受体结合和S1亚基脱落之间的特殊构象进行了探索。

团队首先利用利用流式细胞术，发现跨膜表达的S蛋白在受到ACE2蛋白胞外域的刺激后，能够结合HR1抗体或其配体多肽EK1，而此时S1亚基还没有脱落，提示可能存在一种不同于传统观点的早期融合中间态构象。为了捕获并直观地呈现S蛋白的这种中间态构象，研究团队对S蛋白与ACE2胞外域共孵育产物进行冷冻电镜颗粒筛选。通过长时间的摸索，研究者成功发现并解析了一种高分辨率（3.45 Å）的早期融合中间态构象（E-FIC）。

在E-FIC中，S2亚基发生了构象转变，其中HR1三螺旋结构弹出，而S1亚基组成环状结构结合在S2亚基的底部。通过进一步的结构优化和分析，研究者发现在E-FIC S2亚基的HR1上结合着一段氨基酸序列，将其命名为中间态环——IL770。值得注意的是，S2’位点就位于IL770中，且突出于结合表面形成隆起，这种结构特征有利于蛋白酶的切割。

此外，通过上述构象可以推测蛋白酶对S2’位点的切割可能触发IL770从HR1表面剥脱，从而释放空间以利于HR2结合。通过对融合前和E-FIC结构的对比分析，研究者进而发现S蛋白结合ACE2受体后，S1亚基和S2亚基底部均会向细胞膜方向旋转以实现病毒膜和细胞膜初步拉近，这将有助于缩短融膜肽插入细胞膜所需的距离（图1）。

图1 SARS-CoV-2 S蛋白在诱导膜融合过程中经历的构象变化

设计高效双功能抗病毒候选药物，为开发新型靶向性广谱药物或疫苗提供新思路

通过对E-FIC结构的分析，研究者还发现S1亚基中的RBD与S2亚基中的HR1之间的空间距离被拉近，这一发现也为靶向该中间体的药物设计提供了新思路（图2）。基于此构象，研究者选用了经临床试验证明具有较好活性和安全性的RBD结合药物候选（ACE2蛋白）和HR1的结合药物候选（EK1多肽），设计出双功能域串联药物候选。

据介绍，由于E-FIC结构中HR1表面被IL770所结合，研究者通过竞争性结合实验发现，EK1多肽能够凭借强大的相互作用从IL770中夺取HR1进行结合。随后，为了验证双功能域之间最佳连接子长度，研究者通过表达含有2、5、6、7组连接子的蛋白进行活性筛选，发现由 5组连接子串联的蛋白（AL5E）具有最佳靶点结合活性和广谱性。

后续研究结果表明，上述设计的蛋白类抗病毒活性分子具有失活病毒和抑制病毒双功能。从失活病毒功能方面看，AL5E蛋白上的ACE2功能域诱导游离病毒表面的S蛋白形成融合中间态，该中间态暴露出靠近ACE2的HR1区，随后AL5E蛋白中的EK1功能域与HR1三聚体结合，造成病毒S蛋白锁定在融合中间态，使该病毒粒子丧失感染活性。从抑制病毒功能方面看，AL5E蛋白上的ACE2功能域和EK1功能域也可分别作为抑制剂，抑制病毒对靶细胞的感染。AL5E对新冠病毒及其变异株的抑制活性比ACE2蛋白提高26至623倍，对游离病毒的失活活性提高21至754倍。此外，AL5E对其他使用ACE2受体的冠状病毒均具有很好的抗病毒效果。