摘要：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为工业生物技术的核心菌株，其在高糖环境下优先进行低效的乙醇发酵（克拉布特里效应，Crabtree effect）而非高效呼吸作用的特性，导致了严重的碳源浪费和能量效率低下。这不仅推高了底物成本，增加
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为工业生物技术的核心菌株，其在高糖环境下优先进行低效的乙醇发酵（克拉布特里效应，Crabtree effect）而非高效呼吸作用的特性，导致了严重的碳源浪费和能量效率低下。这不仅推高了底物成本，增加了碳排放，更严重制约了非乙醇类高附加值化学品（如有机酸、萜类）的生物合成。传统策略如敲除丙酮酸脱羧酶（PDC）虽能减少乙醇积累，却引发乙酰辅酶 A 供应不足和 NAD⁺再生障碍，导致细胞生长受阻，难以实际应用。
近期，湖南省农业科学院单杨院士团队在 Nature Communications 发表突破性研究“Sucrose-driven carbon redox rebalancing eliminates the Crabtree effect and boosts energy metabolism in yeast”。该工作通过精妙的代谢工程三重奏——重构蔗糖磷酸化解糖途径、靶向敲除关键调控基因、设计合成能量系统——成功将酿酒酵母改造为克拉布特里效应阴性的高效细胞工厂，显著提升了碳利用效率和多种非乙醇化合物的产量。
研究团队选用廉价蔗糖替代葡萄糖，但酵母裂解蔗糖依赖 ATP 水解，无法利用释放的自由能，导致能量浪费。为解决此问题，团队实施了一项关键代谢重构：引入外源蔗糖磷酸化酶途径。他们用 CRISPR 敲除 SUC2 等蔗糖水解酶基因，阻断天然路径，并引入 LmSP 蔗糖磷酸化酶基因，使蔗糖磷酸化裂解，避开了 ATP 消耗，捕获了自由能。团队还优化了蔗糖运输。他们引入了来自菜豆的不耗能蔗糖转运蛋白 PvSUF 突变体（PvSUF~I209F C265S G326C~），与内源转运蛋白 MAL11 形成双系统，以避免 ATP 消耗。这一系列改造产生了显著效果，工程菌株在蔗糖培养基中的最大比生长速率甚至超过了亲本菌株在葡萄糖上的生长速率。
研究团队利用高效蔗糖利用平台，分步消除克拉布特里效应。第一步，敲除调控糖酵解与呼吸平衡的肌醇焦磷酸酶 OCA5，显著减少乙醇和甘油积累，增强细胞呼吸，部分缓解效应。但未完全消除。第二步，关键一步，敲除核心酶磷酸葡萄糖异构酶 PGI1。PGI1 连接糖酵解（EMP）和戊糖磷酸途径（PPP），传统敲除会阻断糖酵解致死。但蔗糖磷酸解途径的碳源入点为果糖和 G1P，巧妙绕过了 PGI1，避免阻断风险。
当团队进一步敲除 PGI1 得到菌株 ZQS18 时，取得了里程碑式的成果，在蔗糖培养基中，该菌株完全不再积累乙醇，甘油产量也降至极低水平。并且，其胞质 NADH/NAD⁺比率进一步大幅降低。这些数据标志着酵母成功转型为真正的克拉布特里效应阴性（Crabtree-negative）状态！转录组分析为这一表型提供了深层解释：PGI1 的缺失导致 EMP 途径通量下降，而 TCA 循环和呼吸链相关基因表达显著上调，碳代谢流被强制导向了呼吸作用这一高效的能量生成途径。
图 | 分步消除克拉布特里效应
关闭乙醇途径后，胞质 NADH 再氧化成为维持氧化还原平衡的新挑战。团队为此设计了合成能量系统。初版（ZQS48）在 Crabtree 阴性菌株中过表达线粒体外膜 NADH 脱氢酶基因 NDE1/2 将 NADH 的电子送入呼吸链，并引入棕色固氮菌（Azotobacter chroococcum）的转氢酶 AcTH 利用 NADPH 再生 NADH。该系统提升了 ATP 产量，但意外导致乙醇和甘油部分回升。这表明胞质 NAD⁺ 再生不完全，或 AcTH 干扰了辅因子平衡，迫使细胞重启部分溢出代谢以维持稳态。
团队迅速进行系统升级。首先，他们引入了磷酸酮醇酶 LmPK 和磷酸转乙酰酶 CkPTA，构建了一条新的“PTA 途径”。该途径允许戊糖磷酸途径（PPP）的中间产物直接生成乙酰辅酶 A，绕开了传统的丙酮酸节点，增加了向 TCA 循环输入碳的通量，从而减少了对生成乙醇路径的依赖。其次，为了彻底根除残留的溢出代谢，他们逐步敲除了主要的乙醇脱氢酶基因 ADH1/3 和甘油-3-磷酸磷酸酶基因 GPP1/2。
最终优化菌株 ZQS65 表现优异。高效利用蔗糖，乙醇和甘油维持极低水平，NADH/NAD⁺平衡健康，ATP 含量显著提升。关键测试显示，即使人为削弱 TCA 循环，含合成能量系统的菌株生长受限更小，证明该系统能在核心代谢受阻时维持能量供应。5L 发酵罐实验也证实 ZQS65 在生长速率、生物量得率和底物消耗速率上均优于对照菌株。
图 | 设计并优化的合成能量系统高效利用蔗糖，不受 TCA 循环受阻影响
应用验证表明，改造后的克雷伯效应阴性酵母平台在合成乳酸（提升 11 倍）、3-羟基丙酸（提升 8.2 倍）、对香豆酸（翻倍）和法尼烯（产量提升 22% 且得率提高 77%）等多种非乙醇化合物时，产量均实现数倍至数十倍的飞跃性增长。
单杨院士团队通过三重创新策略——蔗糖磷酸解途径、双基因敲除和合成能量系统——构建了克拉布特里效应阴性酵母。该底盘细胞能量效率高，碳原子经济性好，能高效利用蔗糖合成乳酸、3-HP 等高附加值产品，减少碳损失，为可持续生物制造和碳中和提供了强大解决方案。
参考链接：
1.Xiao, Z., Zhao, Y., Wang, Y. et al. Sucrose-driven carbon redox rebalancing eliminates the Crabtree effect and boosts energy metabolism in yeast. Nat Commun 16, 5211 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-60578-8
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来源：生辉SciPhi
