肝细胞癌仑伐替尼耐药的分子机制

摘要：肝细胞癌（HCC）是肝脏最常见的原发性恶性肿瘤，占肝癌病例的75%～85%，是全球第六大常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第三大原因。每年约90万新发病例及83万死亡病例。HCC早期症状不明显，导致大部分患者在确诊时已处于中晚期，无根治性手术适应证，治疗选择有

肝细胞癌（HCC）是肝脏最常见的原发性恶性肿瘤，占肝癌病例的75%～85%，是全球第六大常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第三大原因。每年约90万新发病例及83万死亡病例。HCC早期症状不明显，导致大部分患者在确诊时已处于中晚期，无根治性手术适应证，治疗选择有限。近年来，分子靶向治疗和免疫治疗为晚期HCC患者带来了新的治疗前景。2018年，仑伐替尼（Lenvatinib）成为继索拉非尼之后第二个被美国食品药品监督管理局批准用于治疗晚期HCC的一线药物。REFLECT研究结果显示，仑伐替尼组在总体生存期上与索拉非尼组相比表现出非劣效性（13.6个月 vs 12.3个月），以及在客观应答率（24.1% vs 9.2%）和疾病无进展期（7.4个月 vs 3.7个月）上有显著改善。仑伐替尼的应用改变了索拉非尼作为肝癌唯一一线多靶点酪氨酸激酶受体抑制剂治疗方法的地位，但其疗效受到严重的耐药性限制。

仑伐替尼是一种口服的选择性多靶点酪氨酸激酶受体抑制剂，通过抑制血管内皮生长因子受体（VEGFR）1/2/3与成纤维细胞生长因子受体（FGFR）1/2/3/4，以及干预VEGF和FGF信号通路抑制肿瘤生长。此外，仑伐替尼对高FGFR表达的HCC细胞具有直接的抗增殖作用。同时还参与抑制血小板衍生生长因子受体α以及原癌基因KIT和RET等。尽管如此，其抗肿瘤效果受到耐药性的限制。本文旨在总结和阐明仑伐替尼耐药相关基因和通路，深化临床工作者对其耐药机制的理解，为改善仑伐替尼耐药性提供潜在靶点。

1 表皮生长因子受体（EGFR）

EGFR是受体酪氨酸激酶中ERBB家族中的一员，是一种跨膜糖蛋白受体。其细胞外结构域与相应配体如EGF和转化生长因子α（TGF-α）结合后会诱导同源或异源二聚体形成，引起胞内域酪氨酸激酶活化和多个下游通路激活，参与细胞增殖、生存和分化等过程。EGFR的过度表达和异常激活与HCC的进展转移、不良预后和耐药性相关。Jin等研究发现，仑伐替尼对酪氨酸激酶受体（如FGFR）的抑制反馈激活了EGFR/PAK2/ERK1/2和EGFR/PAK2/ERK5通路，导致MAPK信号通路不能被完全沉默，因此限制了药物疗效，形成了原发性耐药。仑伐替尼与EGFR抑制剂吉非替尼（Gefitinib）联合使用在表达EGFR的肝癌细胞系以及在相应小鼠模型中显示出有效的抗肿瘤增殖作用。与上述研究一致的是，He等研究发现EGFR抑制剂厄洛替尼（Erlotinib）能下调仑伐替尼耐药肝癌细胞中异常激活的ERK信号。当与仑伐替尼联合使用时，厄洛替尼恢复了耐药HCC细胞系对仑伐替尼的敏感性，提高了疗效。另一项研究表明，甲基转移酶样蛋白3介导的m6A修饰通过刺激HCC细胞中EGFR mRNA翻译效率诱导仑伐替尼耐药。Huang等研究表明甲基转移酶样蛋白1介导的tRNA m7G修饰通过促进EGFR通路基因的翻译效率诱导肝癌细胞对仑伐替尼耐药。EGFR通路的异常激活是仑伐替尼耐药一个重要机制。

2 VEGFR

VEGFR是VEGF的受体，主要在血管内皮细胞中表达，促进肿瘤内大量新血管生成并调节血管的通透性，最终促进HCC细胞的生长、迁移和侵袭。Zhao等建立了耐仑伐替尼的HCC细胞系，发现VEGFR2的表达及其下游RAS/MEK/ERK信号通路在耐仑伐替尼的HCC细胞中明显上调。转录因子E26转化特异性序列1的激活促进VEGFR2表达的增强，从而介导对仑伐替尼的耐药性。上调的VEGFR2表达可能是仑伐替尼治疗HCC耐药的预测指标。

3 FGFR

FGF与FGFR的结合诱导细胞增殖、迁移、分化和存活。当FGF/FGFR信号异常时，可诱发多种癌症，包括HCC。FGFR是仑伐替尼的典型靶点。仑伐替尼的长期治疗可引起FGFR激酶结构域的点突变，导致构象改变，阻碍药物在特定模型中的充分结合。体外研究表明，FGFR的把关突变（gatekeeper mutation）是靶向治疗获得性或内在耐药性的常见机制。Zhao等的研究表明高表达的FGFR1诱导AKT/mTOR和ERK信号激活从而导致HCC中的仑伐替尼耐药性。仑伐替尼长期治疗后FGFR1的突变不仅影响仑伐替尼的正常靶向结合降低其疗效，还能激活相关信号通路加强对仑伐替尼的耐药性。

4多药耐药蛋白1（MDR1）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP）

MDR1和BCRP转运体均是重要的ABC转运蛋白，在各种人类癌症中通过促进药物外排来介导抗肿瘤药物的多重耐药性。有研究表明，仑伐替尼是MDR1的底物，使用利福平或酮康唑抑制MDR1可增加健康成人的仑伐替尼血浆浓度。Sun等的研究发现联合使用MDR1和BCRP转运蛋白抑制剂依克立达（Elacridar）和仑伐替尼在体内外表现出显著的协同抗肿瘤作用，同时减少集落形成并下调CD133、EpCAM、SOX-9和c-Myc表达抑制肿瘤干细胞（CSC）的特性。通过抑制MDR1和BCRP转运体来抑制仑伐替尼外排可能是克服仑伐替尼耐药并发挥协同抗肿瘤作用的潜在机制。

5 自噬

自噬是细胞在应激或损伤等条件下利用溶酶体降解细胞器、蛋白质和大分子的过程，对维持应激条件下的细胞稳态至关重要。在癌症中，自噬发挥着双重作用，一方面抑制肿瘤的发生，另一方面支持肿瘤的进展。自噬被认为是肿瘤细胞在营养剥夺下生存的一种适应机制，已被证明在诱导多种肿瘤的耐药性方面发挥着至关重要的作用。Pan等研究发现溶酶体跨膜蛋白5（LAPTM5）可以通过促进自噬体-溶酶体融合来显著提高自噬通量，从而降低HCC对仑伐替尼的敏感性。通过羟氯喹或沉默LAPTM5表达抑制自噬溶酶体形成，与仑伐替尼协同作用抑制肿瘤生长。Zhang等研究结果表明，长链非编码RNA LINC01607通过竞争性结合miR-892b上调p62触发线粒体自噬，降低ROS水平，促进仑伐替尼耐药。然而，Fernández-Palanca等研究表明在体外通过阻断自噬，肝癌细胞增殖和迁移能力得到恢复，导致仑伐替尼的抗肿瘤作用降低。综合以上研究结果，自噬在仑伐替尼对于HCC的疗效中起着双重作用。可能是由于受体位置不同产生的影响不同，也可能是由于不同的通路使得自噬被促进或抑制，自噬对于仑伐替尼疗效影响的具体机制仍有待进一步的研究和探讨。

6 Wnt/β-catenin信号通路

Wnt/β-catenin信号通路的异常激活在多个类型肿瘤中被发现有促进癌细胞生长、诱导上皮-间质转化（EMT）、赋予干细胞样特征和产生治疗耐药性的作用。Wnt/β-catenin通路在HCC中经常被激活，导致肿瘤转移、耐药和恶性进展。Guo等研究发现干扰素调节因子2（IRF2）的高表达上调β-catenin的表达促进了肝癌细胞的增殖，抑制了细胞的凋亡，并增加了对仑伐替尼的耐药性。Wang等研究发现卷曲受体10 （FZD10）通过β-catenin/c-Jun/MEK/ERK轴抑制了肝癌细胞对仑伐替尼治疗的反应性。用靶向FZD10的腺相关病毒治疗耐仑伐替尼HCC可恢复仑伐替尼的抗肿瘤作用。近期，一项研究表明细胞周期蛋白依赖性激酶6（CDK6）直接结合并磷酸化糖原合成酶激酶3β（GSK3β），激活Wnt/β-catenin信号通路，从而导致仑伐替尼耐药，联合应用仑伐替尼和CDK6抑制剂帕博西尼（Palbociclib）可恢复HCC对仑伐替尼的敏感性。提示Wnt/β-catenin在肝癌仑伐替尼耐药中发挥重要作用。

7 Notch信号通路

Notch信号通路广泛参与了多种恶性肿瘤的发生发展，参与调控CSC，与CSC的自我更新能力密切相关。近来，一项研究表明m6A阅读蛋白YTH N6甲基腺苷RNA结合蛋白1（YTHDF1）在高干性HCC中表达上调，YTHDF1与m6A修饰的Notch1 mRNA结合，增强了其稳定性和翻译，从而增加了Notch1基因的表达。通过YTHDF1/m6A/Notch1 mRNA表观遗传学轴促进肿瘤干性和仑伐替尼的耐药性。靶向YTHDF1/m6A/Notch1可以恢复对仑伐替尼的敏感性。Feng等建立了仑伐替尼耐药类器官模型，发现Notch通路调控类器官对仑伐替尼的耐药，联合应用Notch通路抑制剂DAPT可恢复仑伐替尼耐药类器官对仑伐替尼的敏感性。另一项研究结果显示四次跨膜蛋白1（TM4SF1）通过上调肌球蛋白重链9 （MYH9）激活Notch信号通路，最终促进HCC肿瘤干性，并增强HCC细胞对仑伐替尼的耐药性。以上研究均提示Notch信号通路在仑伐替尼耐药中的关键作用。靶向Notch信号通路减少CSC数量和干性是一项有前景的治疗策略。

8 MAPK/ERK信号通路

MAPK/ERK是一种重要的信号传导通路，参与多种细胞生理过程的调控，包括细胞增殖、生存、分化和迁移等。这一信号通路在HCC中常常被异常激活，导致细胞增殖、生存和转移能力提高，从而促进HCC的进展和恶化。最近的研究发现，MAPK/ERK信号通路在HCC仑伐替尼治疗耐药的过程中发挥一定作用。Huang等在体内外仑伐替尼耐药HCC细胞中观察到双特异性磷酸酶4（DUSP 4）缺陷，导致细胞存活、迁移和细胞凋亡的减少。DUSP4是双特异性磷酸酶亚家族的成员，参与相应靶激酶的失活，包括MAPK级联。进一步的研究发现，DUSP4敲除在体内外仑伐替尼治疗期间通过激活MAPK/ERK信号传导增强了HCC细胞存活、增殖和迁移能力。使用MEK抑制剂司美替尼（Selumetinib）可以逆转DUSP4缺失相关的仑伐替尼耐药。另外，Lu等研究发现神经纤维瘤蛋白1（NF1）缺失重新激活PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路，DUSP9缺失激活MAPK/ERK信号通路，从而诱导仑伐替尼耐药。应用MEK抑制剂曲美替尼（Trametinib）能增加HCC对仑伐替尼治疗敏感性。总之，MAPK/ERK通路的异常激活在HCC的发生、进展和治疗抵抗等方面起着重要的作用。使用MEK抑制剂能逆转仑伐替尼耐药，二者联合使用具有更佳的治疗潜力。

9 细胞间质上皮转换因子（c-Met）

c-Met为受体酪氨酸激酶家族成员。其在肿瘤组织或外周血中的异常表达可以作为预后生物标志物以及药物反应的预测生物标志物。Fu等研究发现HGF/c-MET轴通过激活下游PI3K/AKT和MAPK/ERK通路并促进具有高c-MET表达的HCC细胞的EMT来诱导仑伐替尼耐药。仑伐替尼和c-MET抑制剂PHA-665752的联合治疗逆转了HGF/c-MET诱导的耐药性，从而提高了c-MET高表达的HCC细胞的仑伐替尼的抗肿瘤作用。Xu等研究也发现c-Met的过表达和激活有助于HCC细胞对仑伐替尼产生耐药性，并且进一步发现负向调节c-Met表达的上游microRNA——miR-128-3p。miR-128-3p/c-Met轴通过调节耐仑伐替尼HCC细胞的增殖和凋亡相关信号通路参与仑伐替尼耐药。c-Met不仅在肝癌进展中，而且在仑伐替尼耐药中也发挥作用。

10 铁死亡

铁死亡是一种铁依赖性的细胞程序性死亡形式，已被证明在多种疾病中发挥重要作用，包括癌症、神经退行性变和缺血性器官损伤。越来越多的证据还表明其在肿瘤抑制和免疫方面的潜在生理功能。这个过程的特点是脂质ROS的铁依赖性积累。一项研究表明，仑伐替尼通过抑制FGFR4从而抑制胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白和谷胱甘肽过氧化物酶4表达，诱导脂质ROS积累，并引起铁死亡。核因子E2相关因子2（Nrf2）过表达的HCC细胞表现出低脂质ROS水平，抑制仑伐替尼引起的铁死亡，产生对仑伐替尼的耐药性。在使用仑伐替尼治疗期间，抑制铁死亡的发生可能会导致治疗效果的降低，因而可能增加肿瘤细胞对仑伐替尼的耐药性。这为阐明仑伐替尼在HCC中耐药机制提供了新的思路。

11 非编码RNA（ncRNA）

ncRNA是指由基因组转录而成的不编码蛋白质的RNA分子。近年来，因ncRNA参与了胚胎发育、细胞增殖、分化、凋亡、感染以及免疫应答等几乎所有生理或病理过程的调控而受到广泛关注。Duan等通过RNA测序发现lncRNA XIST在仑伐替尼不敏感的HCC细胞中上调。且lncXIST在HCC细胞中通过激活EZH2/NOD2/ERK轴促进仑伐替尼耐药，靶向lncXIST/EZH2/NOD2/ERK轴可能是增强仑伐替尼对HCC细胞疗效的一种有前途的策略。另一项研究表明，lncRNA AC026401.3与有机阳离子转运蛋白1（OCT1）相互作用，促进OCT1在E2F转录因子2启动子区域的募集，通过激活E2F转录因子2的转录，增强肝癌对仑伐替尼的耐药性。Yu等研究发现lncRNA MT1JP通过调节miR-24-3p/BCL2L2轴来抑制细胞凋亡，从而参与肝癌仑伐替尼耐药的发生。Zhang等研究表明circRNA circMED27能够作为ceRNA海绵吸附miR-655-3p上调泛素特异性肽酶28（USP28）的表达，从而增强HCC细胞对仑伐替尼的耐药。近年来，RNA表观遗传学修饰在肿瘤的发生和发展中扮演着关键的调控角色，成为研究的热点。以上研究结果均突显了ncRNA在肝癌中仑伐替尼耐药机制中的重要性，可能成为克服此耐药性的重要靶点。

12 结语

仑伐替尼对于晚期肝癌效果显著，但在靶向治疗过程中，耐药性往往是不可避免的。其耐药机制涉及的分子、信号通路多种多样（表1，图1）。但大多只从体外实验或体内小鼠实验进行耐药机制的阐述，其结果是否适用于真实患者有待考证。随着类器官、液体活检等新技术的应用，有望在克服肿瘤异质性的同时准确识别仑伐替尼敏感性的生物标志物，同时对肿瘤进行动态监测，为患者提供个体化、精准化治疗。