摘要：近日，重庆师范大学秦小健/张汉马课题组在Plant Biotechnology Journal杂志上发表了一篇题为“OsRF2b interacting with OsbZIP61 modulates nitrogen use efficiency and g

植物科学领域保姆级SCI全程投稿发表服务来了！润色、选刊、投稿、返修，直至中刊！

近日，重庆师范大学秦小健/张汉马课题组在Plant Biotechnology Journal杂志上发表了一篇题为“OsRF2b interacting with OsbZIP61 modulates nitrogen use efficiency and grain yield via heterodimers in rice”的研究论文。该研究发现，水稻中bZIP转录因子OsRF2b通过与OsbZIP61相互作用，形成异源二聚体并直接结合OsNRT1.1B启动子，作为氮素利用效率（NUE）和产量的负调控因子调控其表达。这些发现为两个bZIPs参与NUE和产量调控机制提供了新的见解，为水稻遗传育种提供了新的基因资源和理论基础。

氮是植物生长发育中不可或缺的营养元素，硝酸盐作为土壤中最丰富的无机氮形式，不仅参与氮的吸收和同化，还通过硝酸盐信号调控植物的多种生理过程，如种子萌发、根系发育、茎生长和开花等。提高作物的氮素利用效率（NUE）被认为是实现低氮投入高产的最有前途的方法之一。NUE的提高伴随着高效的运输和同化作用，以推动生长和发育，包括增加株高、有效穗数和单株产量等。因此，解析氮素高效利用的分子机制，培育氮高效作物品种，对于保障粮食安全与生态环境安全具有双重重要意义。

碱性亮氨酸拉链(bZIP)家族是维管植物中最多样化的转录因子家族之一，其在植物多种生命过程中发挥着重要作用。其中，OsbZIPs在生物应激反应中的作用也已在先前的研究中得到证实。例如，OsbZIP1可被稻瘟病感染快速诱导，表明OsbZIP1可能在水稻防御病原体的信号转导通路中发挥积极作用（Meng et al.,2005）。此外，两个bZIP蛋白RF2a和RF2b已被鉴定为韧皮部特异性水稻芽状杆菌病毒(RTBV)启动子的转录激活因子，表明它们参与水稻芽状杆菌病(RTD)防御途径（Dai et al.,2008; Dai et al.,2004; Liuet al.,2007; Yin et al.,1997）。另一方面，OsbZIPs已被证实在非生物胁迫中发挥重要作用。例如，bZIP转录因子OsbZIP71与水稻的耐盐性和耐旱性有关。两个bZIP蛋白OsOBF1和LIP19参与了对冷胁迫的反应（Aguan et al.,1993; Shimizu et al.,2005）。尽管bZIP家族转录因子在植物发育过程和逆境响应中已被鉴定和表征，但bZIP在植物NUE中的作用尚不清楚。重庆师范大学秦小健/张汉马课题组对bZIP关键候选因子RF2b及互作蛋白OsbZIP61进行了相关研究。全文主要研究结果如下：

1. OsRF2b编码一个硝态氮响应的bZIP家族转录因子

OsRF2b编码一个bZIP家族蛋白，并且同源基因中bZIP结构域的氨基酸序列在不同植物中具有显著的保守性(图1a)，这表明这些同源基因可能在不同物种中具有相似的功能。系统发育分析表明，OsRF2b与玉米和小米中的同源基因密切相关(图1b)。根据水稻表达谱数据库(RiceXPro)， OsRF2b在所有组织中表达，并能对不同的激素作出反应(图lc、d)，表明OsRF2b存在于所有器官中。通过构建融合GFP的表达载体，发现OsRF2b定位于细胞核(图1e，1f)。为了分析OsRF2b响应氮的表达变化差异，该研究检测了高氮条件下不同时间点OsRF2b的转录水平条件。qRT-PCR结果显示，在高硝酸盐供应条件下，OsRF2b的表达显著下调，而OsNRT1.1B的表达则明显上调(图1g、h)。综上所述，该研究鉴定了bZIP家族基因OsRF2b，该基因编码一个响应硝酸盐的核定位蛋白。这些结果为后续研究OsRF2b参与硝态氮调控通路中的功能提供了基础。

图1 OsRF2b编码响应硝态氮的bZIP家族转录因子

2. OsRF2b的过表达影响氮利用相关基因表达导致NUE和产量降低

为了更全面地研究OsRF2b在氮利用中的作用,该研究构建了OsRF2b过表达载体，并对其转基因株系进行了鉴定。通过对OsRF2b过表达株系的表型和农艺性状进行分析发现，OsRF2b过表达株系表现出生长缓慢和矮化表型，并通过降低氮素吸收和含量以及NUE来影响水稻的生长发育，最终导致籽粒变小和产量降低(图2a-l)。此外，该研究还利用qRT-PCR分析评估了氮利用相关基因在OsRF2b过表达株系中的表达水平。结果表明，氮利用相关基因（包括OsNRT1.1B、OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNIA2和OsNPF8.1）在过表达株系中显著下调。这表明OsRF2b过表达抑制了水稻转基因株系中这些氮利用相关基因的表达(图2m-r)。综上所述，OsRF2b的过表达主要通过调节参与氮同化和信号通路的氮利用相关基因的表达来影响氮吸收。

图2 OsRF2b的过表达影响氮利用相关基因表达导致NUE和产量降低

3. 敲除OsRF2b可提高水稻NUE和产量

为了进一步验证OsRF2b在NUE调控中的作用，该研究利用CRISPR-Cas9方法构建了OsRF2b敲除转基因株系。随后经靶位点测序鉴定出了OsRF2b突变体。对OsRF2b突变体的表型和农艺性状进行分析发现，与野生型相比，这些突变体表现出更高的株高，并通过促进氮素吸收和NUE来调节籽粒大小，从而提高产量(图3a-l)。此外，该研究还利用qRT-PCR分析了OsRF2b突变体中氮利用相关基因的表达水平。结果表明，氮利用相关基因（包括OsNRT1.1A、OsNRT1.1B、OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNAR2.1和OsNPF8.1）在OsRF2b突变体中表达上调。这表明敲除OsRF2b后，通过促进这些氮利用相关基因在OsRF2b突变体中的表达来改善NUE(图3m-r)。综上所述，敲除OsRF2b主要通过调控氮素吸收相关基因的表达来增强水稻的氮素吸收，从而提高水稻NUE，促进水稻生长发育。

图3 敲除OsRF2b提高了水稻NUE和产量

4. OsRF2b通过直接调控OsNRT1.1B的表达参与氮利用调控过程

为了鉴定OsRF2b可直接结合调控氮摄取和氮利用效率的潜在靶基因，该研究首先根据 OsRF2b 过表达株系和 OsRF2b 突变株系中氮利用相关基因表达变化和差异，选择 OsNRT1.1B 和 OsNRT2.1 作为候选基因进行进一步验证。首先利用酵母系统分析发现OsRF2b作为转录因子具有转录活性(图4a)。随后，通过双荧光素酶测定法评估了OsRF2b对水稻原生质体中由OsNRT1.1B和OsNRT2.1启动子驱动的萤火虫荧光素酶基因（LUC）活性的影响（图4b）。结果表明，共同表达proOsNRT1.1B: LUC和35S-RF2b的水稻原生质体中LUC/REN的比值显著低于proOsNRT1.1B: LUC和35S。 然而，在水稻原生质体中，proOsNRT2.1: LUC和35S-RF2b的共同表达与对照相比并没有观察到荧光素酶活性的差异(图4c)，这表明OsRF2b可以作为转录抑制因子下调OsNRT1.1B的表达。此外，Y1H实验证实OsRF2b能与OsNRT1.1B启动子结合，但不能结合OsNRT2.1的启动子(图4d和4e)。EMSA分析表明，OsRF2b能直接结合到OsNRT1.1B fam标记的启动子区域，进一步验证了其体外结合活性(图4f)。最后，该研究通过在烟草表皮细胞中共同表达proOsNRT1.1B: LUC和35S-RF2b来评估转录调控活性。结果表明，OsRF2b能负向调控OsNRT1.1B的表达(图4g)。综上所述，OsRF2b可以直接与OsNRT1.1B启动子结合并调控其表达，从而影响NUE和调控水稻生长发育过程。

图4 OsRF2b直接调控OsNRT1.1B的表达参与氮素利用过程

5. OsbZIP61与OsRF2b互作增强其调控活性且过表达OsbZIP61导致产量降低

已知bZIP家族蛋白能形成异源二聚体，影响DNA结合特异性，并可引起基因表达调控的功能转变，这在先前的研究中已得到证实。该研究通过生化筛选在之前的数据中发现了一个bZIP家族转录因子OsbZIP61，它与转录因子OsRF2b最相似，在水稻中共享高度保守的基序，且也对氮有反应。该研究首先分析了OsbZIP61在水稻原生质体中的定位情况，发现与空载体35S-GFP相比，OsbZIP61与细胞核标记基因共表达，且均定位于细胞核(图5m和5n)。此外，烟草侵染实验发现，OsbZIP61与细胞核标记基因在烟草表皮细胞中共表达，表明OsbZIP61编码一个核定位蛋白(图5k和51)，这与原生质体的结果一致。此外，该研究使用在线工具DMFold(https://zhanggroup.org/DMFold)预测和分析了OsbZIP61的蛋白质结构，包括OsbZIP61-OsbZIP61同源二聚体和OsRF26-OsbZIP61异源二聚体。为了进一步确认OsRF2b和OsbZIP61之间的相互作用，该研究通过原生质体转化和烟草侵染进行了BiFC实验。BiFC结果表明，植物中OsRF2b和OsbZIP61相互作用的荧光蛋白(YFP)信号在细胞核中检测到，并且OsbZIP61可以形成同源二聚体(图5o-r)。LUC分析结果同样表明OsRF2b和OsbZIP61之间存在相互作用(图5s)。此外，EMSA和荧光素酶报告实验进一步研究了OsbZIP61对OsRF2b结合和激活能力的影响。结果表明，OsbZIP61与OsRF2b相互作用后，增强了OsRF2b与OsNRT1.1B的结合活性，并显著抑制了OsNRT1.1B的表达(图5t-v)。此外，OsbZIP61过表达株系表现出矮化表型，通过调节氮响应基因和硝酸盐吸收来损害穗部和籽粒发育，从而导致籽粒产量降低(图5a-j)。综上所述，这些结果证明OsRF2b可以与OsbZIP61相互作用，并通过形成异源二聚体作为NUE和粮食产量的负调节因子。

图5 OsbZIP61与OsRF2b互作增强其结合能力且过表达OsbZIP61导致产量降低

综上所述，该研究结果表明，OsRF2b与OsbZIP61相互作用并通过形成异源二聚体共同负调控OsNRT1.1B的表达，参与水稻NUE和产量相关性状发育调控。今后，通过揭示OsRF2b和OsbZIP61基因等位变异，探索其潜在的应用前景，为培育高NUE水稻品种提供基础。

重庆师范大学秦小健副教授和张汉马教授为本文的共同通讯作者。硕士生李翠萍、文欢、吴源源为论文共同第一作者。本研究得到了国家自然科学基金、重庆市自然科学基金重点和面上项目和重庆市教委科技项目的资助。

References

Meng, X.B., Zhao, W.S., Lin, R.M., Wang, M. & Peng, Y.L. Identification of a novel rice bZIP-type transcription factor gene, OsbZIP1 , involved in response to infection of Magnaporthe grisea. Plant Molecular Biology Reporter 23, 301-302 (2005).

Dai, S. et al. Transgenic rice plants that overexpress transcription factors RF2a and RF2b are tolerant to rice tungro virus replication and disease. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 21012-6 (2008).

Dai, S., Zhang, Z., Chen, S. & Beachy, R.N. RF2b, a rice bZIP transcription activator, interacts with RF2a and is involved in symptom development of rice tungro disease. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 687-92 (2004).

Liu, Y., Dai, S. & Beachy, R.N. Role of the C-terminal domains of rice (Oryza sativa L.) bZIP proteins RF2a and RF2b in regulating transcription. Biochem J 405, 243-9 (2007).

Yin, Y., Zhu, Q., Dai, S., Lamb, C. & Beachy, R.N. RF2a, a bZIP transcriptional activator of the phloem-specific rice tungro bacilliform virus promoter, functions in vascular development. EMBO J 16, 5247-59 (1997).

Aguan, K., Sugawara, K., Suzuki, N. & Kusano, T. Low-temperature-dependent expression of a rice gene encoding a protein with a leucine-zipper motif. Mol Gen Genet 240, 1-8 (1993).

Shimizu, H. et al. LIP19, a basic region leucine zipper protein, is a Fos-like molecular switch in the cold signaling of rice plants. Plant Cell Physiol 46, 1623-34 (2005).

植物科学最前沿，专注于植物科学前沿进展、资讯、招聘信息的发布及方法软件共享等zwkxqy；

来源：琦琦的农村生活