摘要：卵巢癌（ovarian cancer，OV）是指起源于女性卵巢上皮细胞的恶性肿瘤，常发生于围绝经期和绝经后妇女，在女性恶性肿瘤中病死率最高且发病率和死亡率逐年上升，我国OV发病率居全球第1位[1]。OV初期症状不明显，进展期表现出非特异性症状如消化不良、腹胀、

卵巢癌（ovarian cancer，OV）是指起源于女性卵巢上皮细胞的恶性肿瘤，常发生于围绝经期和绝经后妇女，在女性恶性肿瘤中病死率最高且发病率和死亡率逐年上升，我国OV发病率居全球第1位[1]。OV初期症状不明显，进展期表现出非特异性症状如消化不良、腹胀、早饱、排便习惯改变、尿频等，中后期表现出由于肿瘤增大或者腹水导致的盆腔痛、贫血、恶病质及腹部肿胀等症状。因早期难以发现，III期或IV期治疗后5年生存率仅为40%，且由于受累组织难以全部切除、预后较差，复发率高达70%[2]。OV的主要治疗手段包括全子宫及双侧附件切除术、肿瘤细胞减灭术及术后全身性化疗及聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly-adenosine diphosphate ribose polymerase，PARP）抑制剂（PARP inhibitor，PARPi）干预等[3-4]。随着PARPi在临床上的广泛应用，其耐药性问题也备受重视。因而亟需寻找新的干预靶点、作用机制及治疗药物或是寻找可减少或逆转PARPi的治疗药物及方案，使更多的OV患者可以从抗癌治疗中更长期的获益。肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）是一个复杂且不断发展的肿瘤发生、发展的系统微环境，包括周围血管、免疫细胞、成纤维细胞、各种信号分子和细胞外基质等[5]。基质细胞（stromal cell）是器官中结缔组织的一种组分，包括成纤维细胞、周细胞、内皮细胞、免疫细胞、炎症细胞等，参与的多种生物过程如组织缺氧和酸中毒、间质高压形成、生长因子和蛋白水解酶产生及免疫炎性反应等，在肿瘤的发生、发展、转移和治疗耐药中具有重要影响。癌症进展时，基质纤维化被激活，成纤维细胞和间充质干细胞形状、表达水平发生改变，生长因子、细胞因子和趋化因子分泌增加，细胞外基质变得致密且刚性，限制药物通过，干预化疗/放疗药物、靶向治疗药物、激素拮抗剂耐药性等路径影响药物疗效[6]。因此，理解肿瘤微环境中细胞及间质间的相互作用，设计靶向癌细胞-基质相互协同互补的联合疗法可为肿瘤的诊断和治疗提供新途径。

生物信息学技术是利用应用数学、信息学、统计学和计算机科学的方法研究生物学的问题，可高通量处理数据并筛选潜在的生物标志物、靶标等，为新药研发和精准医疗等提供重要技术支持及依据[7]。越来越多的研究表明，癌症的发生和进展从来都不仅仅是由一个靶点、一种机制引起，而传统医学药物具有多靶点、多机制协同作用改善症状的特点，和同领域药物相比具备更低的耐药性和毒性等优点，更有利于患者的长期使用。“癌毒”学说是于20世纪末国医大师周仲瑛针对肿瘤的难治性提出，核心理念在于癌毒为恶性肿瘤发生发展过程中特殊病理因素，癌毒属于中医学“毒邪”的范畴，是在人体脏腑功能失调的基础上产生的一种具有猛烈性、顽固性、流窜性、隐匿性、损正性的病邪，为导致肿瘤发生的特异性致病因素，基于传统医学研究者指出OV病机为“肝肾两虚，湿浊瘀毒”[8]。目前未见基于OV肿瘤微环境干预的中药组方预测报道，因此本研究基于生物信息学技术筛选干预OV基质细胞含量的关键基因，多方验证关键基因的临床价值并基于数据库映射和病因病机筛选潜在的中药组方，为基于基质细胞的OV干预药物开发提供思路和方向。

1 材料与方法

1.1 数据库及分析软件

癌症基因组图谱（Cancer Genome Atlas，TCGA，https://portal.gdc.cancer.gov/）、KM plotter（http:// kmplot.com/analysis/）[9]、Genecards数据库（https://www.genecards.org/）、BAT-MAN-TCM数据库（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm）、GSCA数据库（https://guolab.wchscu.cn/GSCA/#/）[10]、GEPIA数据库（http://gepia2.cancer-pku.cn/#about）[11]。R 4.1.0、ClusterProfiler 4.10.3[12]、DOSE 3.26.2[13]、Limma 3.58.1、ggplot 2.3.3.0、enrichplot 1.6.1、Cytoscape 3.7.2等软件。

1.2 数据下载及整理

从TCGA数据库中下载OV RNA FPKM（fragments per kilobase per million）表达数据及患者的临床信息。经检验下载所得381例活检数据均为OV患者病例。采用ESTIMATE（estimation of stromal and immune cells in malignant tumour tissues using expression data）计算基质细胞得分（stromal score）并以中位数为标准将患者分为高、低基质细胞得分组。

1.3 差异表达基因及富集分析

采用limma包以|log2(fold change)|≥2，P＜0.05为筛选标准，筛选高、低基质细胞得分组差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），并以热图及火山图进行可视化。以P＜0.05、q＜0.05为筛选标准，采用ClusterProfiler包分析DEGs涉及的分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cell component，CC）以及通路。

1.4 关键基因筛选

1.4.1 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI） PPI是指2个或2个以上的蛋白质分子通过非共价键形成蛋白质复合体（protein complex）的过程。将DEGs导入STRING数据库，设置物种为“homo sapiens”进行检索并匹配对应蛋白，设置最低要求的交互分数（minimum required interaction score）为最高置信度（0.900）、隐藏网络中未连接的节点（hide disconnected nodes in the network），分析蛋白之间的相互作用，结果导出用Cytoscape软件可视化并分析。

1.4.2 分子复合物检测（molecular complex detection，MCODE） MCODE基于vertex-weighting方案发现图中局部高密度区域，通过分析庞大的网络中边和节点的关系，寻找出关键的子网络和基因[14]。设置度（degree）cutoff＝2，节点分值（node score）cutoff＝0.2，k-core＝2，max.depth＝100，筛选关键基因。

1.4.3 cytoHubba分析 cytoHubba提供了多种拓扑算法用于预测和探索给定网络中的关键节点和子网络，本研究采用最大团中心性（maximal clique centrality，MCC）法进行分析[15]，提取排名前10基因作为关键基因。

1.4.4 关键基因的确定 将MCODE及cytoHubba筛选所得关键基因取交集，为最终关键基因。

1.5 关键基因临床价值分析

关键基因是基于PPI网络机拓扑结构分析得到，缺乏在OV患者中实际临床价值表征，因此本研究从关键基因表达、免疫细胞浸润、基因集变异分析（gene set variation analysis，GSVA）评分、临床预后4方面进行验证。

1.5.1 关键基因表达 基于GEPIA数据库匹配GTEx（genotype-tissue expression）中正常群体表达信息，设置|log2FC|≥2，P＜0.05分析显著性，并进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

1.5.2 基因表达-免疫细胞浸润-GSVA评分[10,16] 登录GSCA数据库，将关键基因键入搜索框，设置肿瘤类别为“OV”，选择“expression”“immune”“immune infiltration & mRNA expression”“immune infiltration & GSVA score”模块进行分析。

1.5.3 临床预后分析 关键基因输入Kaplan-Meier Plotter[9,17]中，根据质控标准，剔除偏移探针，选择最佳的微阵列探针组来代表基因。

1.6 中药组方预测及作用机制分析

参考刘洋等[18]研究，将关键基因导入Coremine Medical数据库映射出最具潜在干预作用（significance）的传统中药作为组方中创新部分。基于OV“癌毒”理论及病机筛选中药成方中最核心的用药模式及药味，构成组方中的守正部分。将新组方中中药键入BAT-MAN-TCM数据库中，设置Score cutoff＝0.84（LR＝80.88），调整后P值＜0.05，筛选得药物靶点[19]。将药物靶点与DEGs取交集并将交集靶点导入Cytoscape中使用插件Cluego进行基因本体（gene ontology，GO）功能和京都基因与基因百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，设置P＜0.05，根据图形具现化需求调节tree level值，分析预测新组方作用机制。

2 结果

2.1DEGs及富集分析

381例OV患者年龄及生存周期分布如图1所示。按照基质细胞得分中位数（−312.742 068 5）将381例OV患者分为低基质细胞得分组（n＝190）、高基质细胞得分组（n＝191），采用Limma包以|log2FC|≥2［FC表示差异倍数（fold change）］、P＜0.05为标准筛选得202个DEGs，其中92个DEGs表达显著降低，110个DEGs表达显著增高。热图及火山图如图2所示。

利用ClusterProfiler包对DEGs进行GO功能和KEGG通路富集分析，见图3。GO功能分析显示DEGs主要参与循环免疫球蛋白介导的体液免疫应答（humoral immune response mediated by circulating immunoglobulin）、经典途径的补体激活（complement activation，classical pathway）、吞噬功能（phagocytosis）、补体激活（complement activation）、免疫球蛋白复合物（immunoglobulincomplex）、质膜外部组成（external side of plasma membrane）、T细胞受体复合物（T cell receptor complex）、抗原结合（antigen binding）、免疫球蛋白受体结合（immunoglobulin receptor binding）、整合素结合（integrin binding）等生物功能。KEGG分析显示DEGs主要参与病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用（viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor）、细胞因子-细胞因子受体相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、造血细胞谱系（hematopoietic cell lineage）、趋化因子信号（chemokine signaling pathway）、细胞黏附分子（cell adhesion molecules）等通路，主要涉及信号分子和相互作用、免疫系统、运输和分解代谢等功能类别。

2.2 关键基因筛选

DEGs导入STRING数据库映射对应蛋白，PPI网络分析得到201个节点、79条边，PPI富集P＜1.0×10−16。PPI网络导入Cytoscape中可视化，并采用MCODE和cytoHubba分析关键基因，结果如图4所示。

选取MCODE筛选所得评分最高子网络（score＝8.40），该网络内基因最为关键和典型。其中Ⅴ型胶原α1（collagen type V alpha 1，COL5A1）为种子基因，纤维连接蛋白（fibronectin，FN1）、XI型胶原α1（collagen type Ⅺ alpha 1，COL11A1）、I型胶原α2（collagen type I alpha 2，COL1A2）、原纤蛋白1（fibrillin 1，FBN1）、骨膜蛋白（periostin，POSTN）、I型胶原α1（collagen type I alpha 1，COL1A1）、核心蛋白聚糖（decorin，DCN）、V型胶原α2（collagen type Ⅴ alpha 2，COL5A2）、III型胶原α1（collagen type Ⅲ alpha 1，COL3A1）、基膜聚糖（lumican，LUM）为聚集基因。采用cytoHubba中MCC法提取排名前10基因作为关键基因，分别为FN1、LUM、COL5A1、COL3A1、COL5A2、DCN、COL1A1、FBN1、COL1A2、COL11A1。

MCODE及cytoHubba筛选所得关键基因取交集，得到交集基因FN1、LUM、COL5A1、COL3A1、COL5A2、DCN、COL1A1、FBN1、COL1A2、COL11A1，确定为最终关键基因。

2.3 关键基因临床价值验证

2.3.1 关键基因表达 为进一步验证关键基因在正常群体和OV患者卵巢组织中的表达差异，基于GEPIA数据库匹配GTEx中正常群体表达信息，设置|log2FC|≥2，P＜0.05，分析显著性并进行PCA，结果如图5所示，与正常群体相比，OV患者卵巢组织中LUM、COL5A1、COL5A2、DCN、FBN1表达显著增高，COL11A1表达显著降低。PCA显示，关键基因表达在正常群体和OV患者中存在显著差异。

2.3.2 关键基因表达与免疫细胞浸润 已有研究表明，基质作为肿瘤微环境中关键组分可通过多种机制阻碍抗肿瘤免疫和免疫治疗反应，如抑制白细胞浸润、免疫细胞群体形成及诱导T细胞凋亡分子的产生、免疫抑制因子的分泌等。免疫细胞浸润是指免疫细胞（如T细胞、B细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等）在组织内的积聚和聚集，免疫细胞可以通过多种机制识别和攻击肿瘤细胞，同时也可以调节其他免疫细胞的活动，从而影响肿瘤的生长、扩散和治疗反应。GSVA是一种基于生物信息学的分析方法，可用于推断单个样品中基因集/通路的活性程度。GSVA评分代表基因集表达的综合水平，与基因集表达呈正相关。

本研究基于GSCA数据库通过构建关键基因表达-免疫浸润、免疫浸润-GSVA评分的相关性，分析关键基因表达对免疫细胞浸润的干预作用，结果见图6。关键基因表达水平与大多数免疫细胞的浸润呈正相关。其中FN1、DCN、LUM相关性更强，与中央记忆型T细胞（central memory T cell，TCM）、单核细胞（monocyte，M）、适应性调节性T细胞（iTreg）、辅助型T细胞2（T helper 2 cell，Th2）、滤泡辅助T细胞（follicular helper T cell，Tfh）、巨噬细胞（macrophage cell）等浸润呈显著正相关；与B淋巴细胞（B cell）、中性粒细胞（neutrophil，NE）、辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17）等浸润呈显著负相关，其中LUM、DCN、FN1相关性更强且影响更多类别的免疫细胞浸润，见图6-A。GSVA评分代表基因集表达的综合水平，与基因集的表达呈正相关。采用GSVA评分进一步分析免疫细胞浸润与关键基因集表达水平之间的关联，关键基因表达水平与TCM、M、Th2、Tfh、iTreg等呈显著正相关，与NE、B细胞、Th17等呈显著负相关，见图6-B。

2.3.3 生存分析 将关键基因输入Kaplan-Meier Plotter中，根据质控标准，剔除偏移探针，选择最佳的微阵列探针组来代表基因，分析并绘制关键基因表达量对OV患者无进展生存期（progression free survival，PFS，图7）、总生存期（overall survival，OS，图8）、进展后生存期（post progression survival，PPS，图9）的影响，患者生存信息数据集来源GSE14764、GSE15622、GSE18520、GSE19829、GSE23554、GSE26193、GSE26712、GSE27651、GSE30161、GSE3149、GSE51373、GSE63885、GSE65986、GSE9891、TCGA。绘制Kaplan-Meier生存曲线并计算中位生存时间，见表1。

由图7～9及表1可知，关键基因表达对OV患者PFS、OS、PPS均存在显著影响，低表达量的群体中位生存周期及干预关键基因的表达对延长OV患者生存周期具有潜在的价值。

2.4 守正创新中药方预测

2.4.1 创新部分中药预测 关键基因与Coremine Medical数据库映射，以significance为标准，检索潜在治疗中药，基于《中华本草》和《中国药典》2020年版检索映射所得传统中药功能主治，作为组方中创新部分，结果见表2。

2.4.2 守正部分中药预测 “癌毒”病机理论认为，癌毒生于邪盛，邪盛因于正虚。因此研究者提出OV是在肝肾两虚的基础上，湿浊、瘀血、癌毒等病理因素相互搏结，阻滞于卵巢而形成的有形肿块，其核心病机为“肝肾两虚，湿浊瘀毒”，演变过程始于肝肾两虚，继而精、气、血亏虚，脉道失养，因虚致瘀，阻滞气机，津液失布，湿浊内生，湿瘀互结，癌毒内生，癌毒损正，又加重肝肾两虚。临床治疗当以抗癌解毒为核心，祛瘀消癥为关键，利湿化浊为要点，培补肝肾为根本。张夏玲等[8]提出OV核心病机为“肝肾两虚，湿浊瘀毒”，就上述思路检索传统中药成方，分析核心药味作为组方中“守正”部分。

以“湿”为关键词检索得成方846首，包含药味1 115首；以“浊”为关键词检索得成方83个，包含药味201个；以“瘀”为关键词检索得成方485首，包含药味717个；以“毒”为关键词检索得成方478首，包含药味640个；以“肝肾”检索得成方154首，包含中药309个。提取核心用药模式，结果见图10，用药模式频次见表3。去重后川芎、甘草、半夏、黄芩、当归、熟地黄、桔梗、大黄、茯苓构成方中守正部分。

2.5 守正创新中药方作用机制研究

药物组合导入BAT-MAN-TCM中进行检索，设置Target protein retrieval Score cutoff＝0.84（LR＝80.88），创新组（new）检索得化合物715个，对应去重后靶蛋白1 268个；守正组（traditional）检索得化合物2 199个，对应去重后靶蛋白1 749个，二者交集靶蛋白1 078个，合并去重后的守正创新中药方药物靶蛋白1 939个。守正创新方药物靶蛋白与DEGs取交集，结果如图11所示，共有交集靶蛋白34个。

将交集靶点蛋白导入Cytoscape进行GO（BP、CC、MF）和KEGG富集分析，结果使用ClueGo插件可视化，结果见图12，颜色表示该节点的富集情况分类，左侧为每个类别显著性最高条目，右侧为组内其他条目，中间红色圆形节点为靶蛋白，连线代表条目与靶蛋白关联。GO富集部分，交集靶蛋白主要参与调节白细胞分化、血管生成、血管收缩、内胚层细胞分化、血管生成、白细胞趋化等BP，胶原蛋白XI型三聚体、含胶原蛋白的细胞外基质、细胞外基质、基底膜、纤维状胶原三聚等CC，血小板衍生生长因子结合、趋化因子活性、糖胺聚糖结合等MF。KEGG富集部分，交集靶蛋白参与调节糖尿病并发症中的AGE-RAGE、白细胞跨内皮迁移、血管平滑肌收缩、癌症蛋白多糖、蛋白质的消化和吸收、松弛素、ECM 与受体的相互作用等信号通路表达。

3 讨论

目前免疫治疗虽在OV中研究较多，如免疫检查点抑制剂、光免疫疗法、固有免疫疗法、过继性T淋巴细胞免疫治疗、肿瘤疫苗和溶瘤病毒等，但疗效有限，有学者指出可能与肿瘤异质性、免疫抑制分子高表达、免疫细胞低浸润等有关[20-22]，肿瘤微环境在动态调节癌症进展和影响肿瘤治疗结果中的重要性得到了广泛认可，如诱导增殖、抑制细胞凋亡、诱导血管生成、避免缺氧、抑制免疫系统以及远处转移等。恶性实体瘤不仅由肿瘤细胞构成，相反恶性细胞与基质环境中的不同类型细胞相互作用，以促进肿瘤生长、转移。肿瘤基质由非恶性细胞组成，如癌症相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）、间充质细胞、先天和适应性免疫细胞、形成血管的内皮细胞和周细胞以及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）。其中ECM由结构蛋白（胶原蛋白和弹性蛋白）、特殊蛋白（纤维连接蛋白、纤维蛋白和弹性蛋白）以及蛋白多糖组成。此外，基质细胞为构成ECM的重要因素[23]。靶向基质细胞的治疗策略可抑制细胞外基质形成，促进免疫细胞迁移、浸润，缓解肿瘤基质对药物的限制作用，改善免疫、靶向等治疗耐药性，同时作用于微血管生成过程可抑制OV的发生发展（浸润、转移等）等。CAFs是TME中基质细胞的一个高度异质性亚群，也是卵巢肿瘤组织中的主要基质细胞类型之一，可促进癌细胞增殖、血管生成和淋巴管生成、ECM重塑、免疫细胞募集，在肿瘤进展中起着关键作用。在富含转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的卵巢肿瘤微环境中，激活TGF-β受体可在CAFs中诱导Smad信号传导，促进多功能蛋白聚糖基因（versican，VCAN）表达。VCAN不仅可促进CAFs衍生，还可通过激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号，上调运动、侵袭相关基因CD44、HMMR和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9，MMP9）促进癌细胞的迁移和侵袭。CAFs表达微纤维相关蛋白5（microfibril associated protein 5 gene，MFAP5）与癌细胞上αVβ3整合素结合，并激活钙依赖的黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）/反应结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）/肌钙蛋白C1（troponin C1，TNNC1）信号通路，随后刺激F-肌动蛋白细胞骨架的重组，增强OV细胞的运动性。CAFs可表达趋化因子C-X-C基序趋化因子配体11（C-X-C motif chemokine ligand 11，CXCL11），激活癌细胞表面的趋化因子C-X-C基序趋化因子受体3（C-X-C motif chemokine receptor 3，CXCR3）促进癌细胞生长和迁移[24-25]。内皮细胞是肿瘤脉管系统的基本组成部分，与肿瘤的生长、转移和对化疗的反应密切相关。内皮细胞表达血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）促进血管内皮细胞的增殖和血管形成，VEGFC和VEGFD促进淋巴内皮细胞的增殖和激活及淋巴管形成。临床研究显示，VEGF含量与OA患者腹水形成有关，为患者生存的独立预测因子。此外，在3个周期的铂类化疗后，治疗前的VEGF水平与糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）水平直接相关，表明VEGF可作为OV化疗难治性的预测指标[26-27]。其他基质细胞如脂肪细胞、间充质细胞分别通过不同途径干预OV进展[28]。Lou等[29]指出OV患者中肿瘤-基质比例与铂类化疗耐药性相关，并建议在OV早期初始诊断时进行评估，并制定相应的治疗策略。因此本研究选择从基质细胞评分的角度探究OV干预策略。

本研究首先基于基质细胞得分筛选DEGs并进行富集分析。GO生物功能富集分析显示，DEGs主要与免疫功能、细胞基质组成、微血管生成等过程相关。KEGG通路富集分析显示，DEGs主要与信号分子和相互作用、免疫系统、运输和分解代谢等功能相关。研究表明，白细胞介素（interleukin，IL，如IL-1、IL-6、IL-8）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等由肿瘤细胞产生，并由肿瘤微环境中的免疫细胞激活[30-31]。先天性免疫应答的激活依赖于巨噬细胞和树突状细胞通过分泌趋化因子如IL-8和单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant proteins-1，MCP-1），并诱导中性粒细胞、淋巴细胞和自然杀伤细胞的募集，产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）、细胞因子、趋化因子和生长因子。细胞因子与肿瘤细胞表面Toll样受体（toll-like receptors，TLRs）的相互作用诱导经由NF-κB及信号转导-转录激活因子（signal transducers and activators of transcription，STAT）等促炎途径的活化[32]。MCP-1和集落刺激因子1（colony-stimulating factor1，CSF-1）等介导肿瘤相关巨噬细胞TAMs向肿瘤微环境中的浸润，TAMs的极性经由与γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、TNF-α和TLR介导的与内毒素的相互作用而转化为M1表型，IL-4/IL-13、IL-10和TGF-β的刺激转化为M2表型[33]。M2巨噬细胞释放免疫抑制细胞因子（IL-10、TGF-β）、程序性死亡配体-1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）的高表达和免疫抑制分子B7-H4分泌抑制适应性免疫应答，使细胞毒性T细胞反应失活，与OA肿瘤分期、进展密切相关[34-35]。研究显示全球15.5%的OA病例为人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）阳性[36]。研究表明HPVE6/E7在卵巢肿瘤中表达，HR-HPV感染导致OA中p53表达降低和p16表达增加[37]，另外HPV介导的肿瘤抑制基因启动子如细胞黏附分子1（cell adhesion molecule 1，CADM1）、髓鞘和淋巴蛋白（myelin and lymphocyte protein，MAL）、配对盒1（paired box-1，PAX1）、腺苷酸环化酶激活多肽1（adenylate cyclase activating polypeptide 1，ADCYAP1）、分泌性缺失相关蛋白（secreted frizzled related protein，SFRP）和腺瘤性息肉样腺癌大肠（adenomatous polyposis coli carcinoma，APC）高甲基化，对OV的发展具有重要意义[38-39]。综上，筛选所得DEGs与OV发生发展机制相适应。

进一步采用PPI、MCODE和cytoHubba拓扑筛选影响基质细胞丰度的关键基因。FN1是许多细胞外基质的核心组分，通过与细胞表面整合素受体的直接相互作用调节各种细胞活动，经由多种贴壁细胞合成并编制成纤维网。FN1为OV重要预后因子[40-41]，与肿瘤细胞系的迁移和浸润有关，FN1高表达可阻止治疗药物引起的OV细胞凋亡，临床数据证实FN1为OV进展良好的标志物并且可能是OV进展核心[42]。此外，难治性晚期OV的临床特征表明，腹膜充当转移性肿瘤的锚定点，使持续性OV细胞得以存活，OV相关间皮细胞（oxygenated alkynyl carbon materials，OACMs）之间相互作用激活FN1/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路诱导OV细胞产生铂耐药性，同时OV细胞和OACMs之间的信号传导促进OV细胞转移和免疫逃逸，OACMs为OV腹膜扩散潜在的新治疗靶点[43-44]。LUM是ECM的重要组成部分，能与层黏连蛋白结合，可诱导蛋白多糖组成变化，调节细胞周期，其异常表达与肿瘤的转移和侵袭密切相关。LUM在多种耐药OV细胞系中过度表达[45]，且与拓扑替康呈剂量和时间相关性增加，此外与COL3A1的共表达表明LUM在胶原纤维形成中的重要性[46-47]。COL5A1为胶原蛋白家族蛋白，参与细胞外基质的形成，也有报道COL5A1为缺氧相关基因。V型胶原蛋白是原纤维形成胶原蛋白的成分之一，通过与I型或II型胶原蛋白形成共聚物来调节异型胶原原纤维的长度和丰度，在细胞外基质组织中发挥关键作用[48]。COL5A1在OV细胞和组织中表达较高，敲低可抑制OV细胞的增殖和迁移，且在紫杉醇（paclitaxel，PTX）耐药OV细胞中过表达。生存分析显示COL5A1表达升高与较差的生存结果相关，并与OV患者的肿瘤分期相关。COL5A1是与巨噬细胞浸润和M2极化相关的关键基因，并且与OV中浸润免疫细胞的比例相关，表明COL5A1可能是OV中的免疫治疗靶点[49]。COL3A1是一种与化疗耐药相关的非纤维状胶原蛋白，为OV细胞系中表达最丰富的胶原蛋白，在紫杉醇、托泊替康和顺铂耐药细胞系中高表达[50]，与OV患者总生存期缩短有关[51]，miR-let-7b/COL3A1调控途径在OV侵袭性和化疗耐药性中发挥作用[52]。COL5A2属于胶原蛋白家族，在OV组织中主要由CAFs表达，与正常卵巢组织相比，COL5A2在OV组织中高表达，且当COL5A2高表达时，OV患者的预后较差。COL5A2通过与OV细胞表面的ITGAV结合，激活OV细胞的FAK/磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）/Akt信号通路，促进OV的增殖、迁移和侵袭[53]。小分子亮氨酸重复蛋白聚糖（small leucine-rich proteoglycans，SLRPs）家族广泛存在于ECM中，参与基质形成，调节癌细胞增殖、血管生成和迁移。DCN为I型SLRPs之一，与多种细胞因子或膜受体相互作用，参与胶原纤维形成的调节[54]。研究发现DCN可以在体外抑制多种肿瘤细胞的增殖和迁移。OV组织中DCN的表达显著高于正常组织，但晚期和早期OV之间的差异不显著，DCN是肿瘤发生的致癌基因[55]。COL1A1也为胶原家族的蛋白，主要参与细胞外基质结构的组成，与肿瘤侵袭和进展、化疗耐药相关[56-57]。FBN1是构成细胞外基质微纤维的主要成分，其主要作用是保持结缔组织的形态完整和功能正常。FBN1表达失调，经由极光激酶A（aurora kinase A，Aurora-A）、乳腺癌易感基因2（breast cancer susceptibility gene 2，BRCA2）信号转导，与肿瘤细胞的侵袭和转移相关[58]。此外FBN1与较差的总生存率以及高级别浆液性OV的晚期阶段有关[59]。COL1A2也为胶原家族的蛋白，相较于正常组织表达显著增加，且与OV的不良预后相关[60]。COL11A1也为胶原家族的蛋白，敲低会导致细胞迁移、侵袭和肿瘤进展减少，靶向胶原蛋白可能是预防OV进展和转移的有效方法[61]。此外亦有研究指出COL11A1为OV复发和不良的临床事件预测因子[62]。关键基因主要与ECM形成相关，切片染色研究显示，与原发性肿瘤相比，转移性肿瘤显示出成纤维细胞反应，其特征是肿瘤病灶周围ECM密集转移组织中纤维性胶原明显增加[63]，关键基因表达均与OV组织病理密切相关。本研究对关键基因临床价值进一步分析显示，关键基因表达与患者PFS/OS/PPS密切相关，与正常群体存在显著差异。同时关键基因无论是个体还是综合表达均与免疫细胞浸润显著相关。综上，关键基因的筛选结果不仅符合网络拓扑学，也具有充分的临床价值。

肿瘤微环境是中医肿瘤辨证论治的物质基础，与肿瘤细胞的免疫逃逸密切相关。肿瘤微环境的改变促进肿瘤细胞的诱导分化，中医肿瘤辨证论治的实质就是干预肿瘤微环境[64]。故本研究最后基于关键基因预测得南木香、千层塔等靶向中药，同时基于“癌毒”理论的OV病机筛选得川芎、甘草等靶向中药。OV病因病机为“肝肾两虚，肝肾两虚，湿浊瘀毒”，临床治疗上，当以抗癌解毒为核心，祛瘀消癥为关键，利湿化浊为要点，培补肝肾为根本。筛选所得南木香、千层塔、茺蔚子、肿节风等中药有解毒、破瘀、散结等中药作用，杜仲、鹿角等中药有温肾阳、舒肝、强筋骨等作用，均属于上述治则。现代药理学研究显示，守正创新组方中药味有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降糖、调血脂、补肾、补血、保肝等多种活性[65-73]，研究预测所得药味从中医理论和现代医学角度均具有较高的可信度。南木香中木香烃内酯可通过时间-浓度相关性抑制卵巢癌细胞的生长增殖、诱导凋亡和阻滞细胞周期在G2/M期，抑制腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路进而抑制OV细胞的自噬[74]；千层塔中serratezomines A、B对多种肿瘤细胞有较好的细胞毒活性[75]；茺蔚子中phlomistetraol B有较好的抗肿瘤细胞迁移及抗增殖作用[76]；猫抓草为治疗卵巢癌常用药物，其总皂苷、多糖、脂肪酸等对多种肿瘤细胞均有不同程度的抑制及杀伤作用[68]；杜仲中黄酮、三萜及总多糖成分可将肿瘤细胞阻滞在S期，阻止其进一步的增殖并作用于线粒体诱导其凋亡[77-78]；肿节风中萜类化合物、香豆素和酚酸类等成分可抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制细胞端粒酶活性、抑制细胞侵袭和迁移，在临床中肿节风治疗各种恶性肿瘤均有一定的疗效，主要表现在改善临床症状、减轻不良反应以及延长生存期等，可以起到增效、增敏作用，且临床用药较安全[79]；马红丸为临床常用抗肿瘤复方制剂，其中包含红娘子，其蛋白对多种肿瘤细胞均有抑制及诱导凋亡作用[80]。林丽珠教授以温阳法治疗卵巢癌中多次运用预知子、猫抓草等中药，患者病情控制良好，预知子中常春藤皂苷元等成分对不同肿瘤细胞均有抑制作用[72,81]。堇菜中植物环蛋白对16种肿瘤细胞均有细胞毒性作用，对肿瘤细胞的细胞毒活性比对正常细胞敏感[82]，临床应用中大剂量使用堇菜紫花地丁解毒[83]，用鹿角作为善补类动物药，以扶正治癌为理论指导，从肝肾论治[84]。守正部分药味川芎、甘草、半夏、黄芩、当归、熟地黄、桔梗、大黄、茯苓等在不仅前述创新部分中药组方中均有提及，也在临床用药中均为高频次使用药味[84-88]。

采用复方网络药理学分析守正创新中药方作用机制，组方与DEGs有交集靶蛋白34个，占DEGs 16.8%，关键基因均包含在内。GO富集分析显示，交集靶蛋白主要参与调节白细胞分化、血管生成、胶原蛋白XI型三聚体、细胞外基质、基底膜、血小板衍生生长因子结合、趋化因子活性等生物功能，与OV关键基因和进展中组织病理学变化相对应。KEGG富集分析显示，交集靶蛋白参与调节糖尿病并发症中的AGE-RAGE、白细胞跨内皮迁移、血管平滑肌收缩、癌症蛋白多糖、蛋白质的消化和吸收、松弛素、ECM与受体的相互作用等通路。研究表明，AGE-RAGE在肿瘤转移、化疗耐药和癌症复发中可促进癌症进展和患者死亡，在肿瘤细胞代谢和侵袭方面，糖酵解生成的AGEs和AGE活化的RAGE共同引发异常的分子途径，致使肿瘤恶性侵袭。并且AGEs作为代谢突变的副产物通过改变代谢组、表观基因组和微生物组，胁迫细胞间、细胞内和细胞外的微环境，最终导致癌症发生。AGE-RAGE协同可诱导三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）激增获取剩余能量、自噬以获得细胞凋亡逃逸和肿瘤耐药、胰岛素样生长因子-1表达导致慢性炎症和血管生成、高迁移率族蛋白-B1表达以获得免疫耐受、S100蛋白表达以获得肿瘤细胞转移、p53蛋白降解以降低肿瘤抑制作用等，AGEs在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和胰腺癌的侵袭性中被明确报道，癌症患者的AGEs水平高于健康对照组，晚期AGEs水平高于局限性阶段[89-91]，因此AGE/AGEs为癌症治疗和药物研发中重要通路。其余通路均与免疫细胞浸润、细胞外基质调节等相关，均与OV发生发展过程密切相关。

4 结论

OV作为“妇癌之王”，治疗预后不佳，与发现时间晚、免疫治疗耐药、化学/靶向治疗耐药、激素治疗耐药等相关，而目前卵巢癌治疗多关注于癌细胞和免疫细胞，忽略了肿瘤微环境中的基质细胞和基质。基质细胞分泌多种影响血管生成、增殖、侵袭和转移的因子，其中CAFs是ECM的主要来源。基质作为肿瘤微环境的重要成分，其特有的生物学特征（如组织缺氧和酸中毒、间质高压形成，大量生长因子和蛋白水解酶的产生及免疫炎性反应等）在肿瘤的发生、发展、转移和治疗耐药中具有重要影响，在癌症治疗策略中应当包含靶向基质的策略。现有的中药新药研发多经由古代经典名方、临床协定方以及院内制剂转化而来，却忽略了生物信息学等技术在中药新方早期发现中的应用。现有文献中有报道的预测组方仅从“靶点-中药”角度出发，缺少了中医药传统理论的应用。

因此本研究基于基质细胞筛选关键基因，充分发挥中药复方“多成分、多靶点、多机制”协同特点，同时结合传统医学对于肿瘤微环境及OV的理解筛选基于中医理论药味，构建守正创新的OV治疗中药组方。然而本研究亦有不足之处，仅从现有研究进行归纳总结，尚未就预测组方进一步开展体内外实验验证。本研究可为基于OV微环境的中药复方药物开发提供组方思路，也可为靶向肿瘤微环境中其他的成分或其他癌症类别药物开发提供参考借鉴。

来 源：杨志城，孙彩虹，李瑶瑶，叶 亮，叶 冠．卵巢癌肿瘤微环境关键基因遴选及守正创新中药方预测 [J]. 中草药, 2024, 55(24): 8499-8516.

来源：天津中草药