摘要：A族肠道病毒(EV-A)包含25种血清型，可引起多种疾病，包括手足口病、咽峡炎、心肌炎、脑炎、无菌性脑膜炎和急性弛缓性麻痹，甚至死亡。据报道，EV-A成员柯萨奇病毒CVA2、CVA3、CVA4、CVA5、CVA6、CVA10和CVA12使用KREMEN1 (K
A族肠道病毒(EV-A)包含25种血清型，可引起多种疾病，包括手足口病、咽峡炎、心肌炎、脑炎、无菌性脑膜炎和急性弛缓性麻痹，甚至死亡。据报道，EV-A成员柯萨奇病毒CVA2、CVA3、CVA4、CVA5、CVA6、CVA10和CVA12使用KREMEN1 (KRM1)蛋白作为细胞受体。然而，KRM1受体广谱识别这七种肠道病毒的分子基础仍然不清楚。
近期，上海市重大传染病和生物安全研究院张超课题组在微生物学国际高水平期刊mBio在线发表了题为“Completely conserved VP2 residue K140 of KREMEN1-dependent enteroviruses is critical for virus-receptor interactions and viral infection”的研究性论文。该研究报道了VP2残基K140在所有依赖KRM1受体的肠道病毒中均完全保守，并在病毒受体结合和病毒感染中发挥至关重要的作用。
张超课题组在2023年的研究揭示过VP2残基N142（命名为N2142）对于CVA10结合KRM1受体和感染非常重要（PLOS Pathogens, 2023）。N2142在CVA2、CVA4和CVA6病毒中高度保守，而在CVA3、CVA5和CVA12中则为其他氨基酸（T、S或Q）（图 1A）。因此，仅凭N2142残基不足以解释为什么这么多种肠道病毒可以共用一种受体蛋白KRM1。之前发现的不足，促使其课题组进一步研究其他可能的分子机制。
在本研究中，研究者首先通过结构分析，发现VP2蛋白的EF loop，特别该loop的N2138到E2143位残基，是CVA10病毒与KRM1受体密切接触的关键区域之一（图1B-C）。利用CVA10的感染性克隆，对该区域的残基进行丙氨酸突变扫描，在293T细胞中拯救病毒，然后在RD细胞中扩增一代，并测定滴度。野生型（WT）CVA10以及突变体N2138A、T2139A、P2141A和E2143A均成功拯救，并得到测序证实，这些突变病毒仍对可溶性受体蛋白hKRM1-Fc的中和高度敏感（图1D），提示这些位点对于CVA10感染和受体结合而言可能不重要。然而，对于K2140A突变体，在RD细胞中未检测到明显的细胞病变和病毒滴度（图1D）。这些结果表明VP2残基K140 （K2140）可能是CVA10感染的关键残基。
K2140A突变似乎对CVA10有害。由于残基K2140位于病毒表面，高度暴露，该位置的突变可能会影响病毒的吸附和进入，而不是病毒的复制、组装和释放。因此，提出了一个假设：K2140A突变体已在转染的293T细胞中得到拯救，但293T拯救出的突变病毒可能无法有效结合和感染RD细胞，导致RD没有出现病变和病毒滴度。为了验证该假设，对感染性克隆质粒转染的HEK 293T细胞的上清液直接进行检测，去掉RD细胞扩增步骤。从转染的293T细胞培养上清（1L体积）中成功纯化出了CVA10-WT和CVA10-K2140A突变体的成熟病毒颗粒，并得到负染电镜的证实（图1E-F）。
细胞吸附实验证明K2140A突变会显著降低CVA10病毒对RD细胞表面的结合能力（图1G）。与之一致的是，受体结合ELISA实验证明K2140A突变可使CVA10与KRM1受体蛋白的结合活性丧失（图1H）。乳鼠感染实验证明K2140A突变可以显著降低CVA10对小鼠的致病力 (图1I)。综上，这些结果表明残基K2140不仅在CVA10的受体识别、细胞吸附和病毒感染中起着至关重要的作用，而且在CVA10对小鼠的毒力中也发挥关键作用。
为了进一步测试2140位的K残基是否是CVA10感染所必需的，利用CVA10感染性克隆质粒对2140位进行饱和式突变分析，用各种其他氨基酸取代K2140。转染293T细胞拯救，然后在RD细胞中扩增，测定滴度并测序。如图1J-K所示，只有CVA10-K2140R突变病毒成功拯救，并且遗传稳定，但K2140R病毒的滴度和受体结合活性明显低于野生型病毒。而其余突变体要么没有病毒滴度，要么产生回复突变。因此饱和式突变分析证明了2140位Lys残基在CVA10感染中的重要性。
图1. VP2 残基K140（K2140）在CVA10病毒的受体识别、病毒感染和小鼠体内致病力中发挥了不可或缺的作用。
据报道，除CVA10外，多种其他肠道病毒，包括CVA2、CVA3、CVA4、CVA5、CVA6和CVA12，也使用KRM1蛋白作为受体。为了评估这些肠道病毒中K2140残基的保守性，从NCBI数据库下载了所有VP2蛋白序列并进行了比对。分析发现K2140残基在所有依赖KRM1的肠道病毒型别中完全保守（图2A）。
接下来研究了残基K2140是否在其他使用KRM1的肠道病毒感染中发挥关键作用。近年来，CVA6已成为全球手足口病疫情的主要病原体。因此首先探究了K2140突变对CVA6感染的影响。将K2140A和K2140R突变分别引入之前报道过的CVA6感染性克隆中，进行病毒拯救。如图2C显示，RD细胞中未检测到CVA6-K2140A突变体的病毒滴度。此外，扩增CVA6-K2140R的尝试也失败了，因为在细胞培养中发生了回复突变。这些结果表明K2140残基是CVA6感染所必需的。
为了评估残基K2140在CVA2、CVA3、CVA4、CVA5和CVA12感染中的作用，全基因合成了这些病毒的原型株的感染性克隆质粒并尝试拯救这些病毒。CVA4和CVA12的原型株拯救需要在RD细胞上连续传代多次后方能出现明显的细胞病变和病毒滴度。而CVA2、CVA3和CVA5的原型株拯救即使多次传代后仍未观察到细胞病变和病毒滴度。为克服这一困难，研究者开发了一种新的高效的方法来快速拯救肠道病毒，即用其他肠道病毒的开放阅读框 (ORF) 替换CVA10感染性克隆中的ORF（图2B）。注意：其他病毒的ORF片段需要通过反转录PCR从经过细胞适应的高滴度的病毒毒株中获得。用这种新方法成功拯救了CVA2、CVA3、CVA4、CVA5和CVA12病毒，在RD细胞中仅需扩增一代便可产生明显的细胞病变和滴度（图2C）。在这些病毒的感染性克隆中分别引入K2140A和K2140R突变，结果发现这些突变病毒要么没有病毒滴度，要么产生回复突变。综上所述，这些结果证明了K2140残基在所有依赖KRM1的肠道病毒型别的感染中都发挥重要的作用。
此外，不同EV-A血清型病毒的序列比对显示K2140残基在CVA8病毒中也是保守的（图1A，2A）。利用上述嵌合策略构建了CVA8的感染性克隆质粒,可以成功拯救CVA8病毒。K2140A和K2140R突变实验证明了K2140残基对于CVA8感染至关重要（图2C）。迄今为止，CVA8的细胞受体尚未被鉴定。研究者推测CVA8病毒可能通过残基K2140使用KRM1作为细胞受体。ELISA实验证明了CVA8病毒颗粒可以与人KRM1和鼠KRM1蛋白发生直接结合（图2D）。KRM1基因的敲除及回补实验证明了KRM1对于CVA8感染RD细胞至关重要（图2E）。这些实验结果证明了CVA8的细胞受体确实是KRM1蛋白。
图2. 残基K2140在所有依赖KRM1的肠道病毒中均完全保守，并在其感染中发挥关键作用。之前未报到受体利用的CVA8病毒也通过K2140残基利用KRM1蛋白作为细胞受体。
综上，该研究揭示了VP2残基K140在所有依赖KRM1的肠道病毒型别中均是绝对保守的，并且对于病毒-受体相互作用和病毒感染至关重要。这些发现有助于更深入地了解肠道病毒感染的分子基础，也为开发广谱抗肠道病毒药物提供了宝贵的信息。
中国科学院硕士研究生刘则宇为本文第一作者。上海市重大传染病和生物安全研究院张超青年研究员为本文唯一通讯作者。该研究得到了复旦大学附属中山医院章树业研究员、中国疾控中心张勇研究员、郑州大学晋乐飞副教授、厦门大学程通教授、中国科学院上海免疫与感染研究所的郝沛研究员和公共技术平台人员田原等人的大力协助。该研究得到了国家自然科学基金和上海市市级科技重大专项“重大突发传染病防控关键核心技术研究”的资金支持。
本期编辑：Chem LT
来源：老尹的科学课堂