Cell丨活细胞内直接接触DNA的蛋白质动态图谱

摘要：在真核细胞中，DNA与蛋白质的相互作用构成了基因组功能调控的核心基础。DNA并非以裸露的线性分子形式存在，而是与组蛋白、RNA以及大量染色质相关蛋白共同构成高度组织化的三维空间结构。这种复杂的核内环境使得只有特定蛋白质能够在特定时间点直接接触DNA，参与调控基

撰文 | 易

在真核细胞中，DNA与蛋白质的相互作用构成了基因组功能调控的核心基础。DNA并非以裸露的线性分子形式存在，而是与组蛋白、RNA以及大量染色质相关蛋白共同构成高度组织化的三维空间结构。这种复杂的核内环境使得只有特定蛋白质能够在特定时间点直接接触DNA，参与调控基因转录、DNA复制和损伤修复等关键生命过程。然而，长期以来人们面临一个重大技术瓶颈：传统研究方法如甲醛交联虽然能固定蛋白质-DNA相互作用，但会同时捕获间接关联的蛋白质网络；而基于紫外光的交联技术又因DNA自身光反应性较低而效率不足。这种技术局限导致我们对基因组调控的认识存在巨大空白，特别是在动态生理条件下蛋白质如何精确识别和结合特定DNA序列的机制仍不清楚。此外，染色质的高度可塑性使得蛋白质-DNA相互作用网络会随着细胞状态变化而快速重组，这种动态特性更增加了研究的复杂性。因此，开发一种能在活细胞中高灵敏度、高特异性捕获直接蛋白质-DNA相互作用的技术，成为当前分子生物学领域亟待突破的关键挑战。

近日，德国慕尼黑工业大学Bernhard Kuster在Cell期刊上发表题为The human proteome with direct physicalaccess to DNA的研究论文，通过革命性的光交联技术，首次绘制了活细胞内直接接触DNA的蛋白质动态图谱，揭示了从转录调控到DNA修复的分子机制，为理解基因组调控和疾病治疗提供了全新视角。

为了突破这一技术瓶颈，作者团队开创性地开发了一套整合代谢标记、高效光交联和深度蛋白质组学的系统性研究方法。该技术的核心创新在于设计了一种新型高功率365nm LED阵列照射系统（UVEN），配合代谢标记的光敏核苷酸类似物4-硫代胸苷（4ST），实现了活细胞内蛋白质-DNA相互作用的“零距离”交联。与传统方法相比，UVEN系统将光交联效率提升了近百倍，同时最大程度避免了DNA损伤。在样品处理方面，作者开发了名为XDNAX的多步变性纯化流程，通过硫氰酸胍-酚-氯仿梯度提取结合硅胶柱纯化，可有效去除99%以上的非特异性结合蛋白，显著提高了检测信噪比。在分析层面，整合了稳定同位素标记（SILAC）定量蛋白质组学和深度机器学习算法，不仅能够全基因组规模鉴定DNA结合蛋白，还能以单氨基酸分辨率精确定位蛋白质-DNA相互作用界面。应用此方法首次实现了对蛋白质翻译后修饰（如磷酸化、泛素化）在DNA结合过程中的动态监测，为理解表观遗传调控提供了全新维度。

通过这一革命性的技术平台，作者在人类乳腺癌细胞系中绘制了迄今为止最全面、最精确的蛋白质-DNA相互作用动态图谱。不仅鉴定到1805种与DNA直接接触的蛋白质分子，更重要的是揭示了这些相互作用在时间和空间维度上的精细调控机制。在基础转录调控方面，本研究发现雌激素受体ERα在配体刺激下表现出惊人的快速响应能力，在45分钟内其DNA结合丰度可提升30倍以上。这一过程伴随着一个精密的级联反应：首先是染色质重塑复合物SMARCA4的快速招募，随后RNA聚合酶II及其相关转录机器在特定基因组位点的有序组装。通过建立雌激素浓度梯度实验，首次在活细胞环境中精确测定了ERα与DNA结合的半数有效浓度（EC 50 ）为35pM，这一数值与体外实验测得的结果高度吻合，验证了新方法的可靠性。

在DNA损伤响应领域，本研究对三种临床常用化疗药物（顺铂、依托泊苷和奥沙利铂）的作用机制进行了系统性解析。顺铂处理主要激活了经典的ATM-CHEK2 DNA损伤信号通路，同时诱导过氧化物还原酶PRDX1/2形成特殊的十聚体环状结构，这种结构可能通过物理包绕DNA双螺旋来保护损伤位点。依托泊苷则特异性地导致拓扑异构酶IIα/β在DNA上的异常滞留，并触发SUMO连接酶PIAS4介导的蛋白质降解通路。而奥沙利铂展现出独特的双重效应：早期（4小时内）引起核糖体生物合成相关蛋白的快速解离，后期（24小时后）则导致核仁结构的显著解体。这些发现不仅阐明了不同化疗药物的分子作用机制，更为开发联合用药策略提供了重要线索。

在染色质动态调控方面，本研究取得了一些突破性发现。通过高时间分辨率（每分钟采样）的监测，捕捉到BAF染色质重塑复合物被抑制后，组蛋白伴侣ANP32A/E在4分钟内就快速结合DNA的早期事件。这种快速响应可能通过两种机制实现：ANP32A通过其INHAT结构域竞争性抑制组蛋白乙酰化，而ANP32E则通过移除H2A.Z变体来改变染色质可及性。研究还发现了一类新型的 “ 快速响应因子 ” ，这些蛋白质能够在数分钟内完成从细胞质到细胞核的转位，并迅速结合特定基因组区域。在结构生物学层面，本研究首次系统证明了内在无序蛋白区域（IDRs）在介导蛋白质-DNA相互作用中的关键作用。通过整合交联质谱数据和AlphaFold结构预测，发现富含多聚谷氨酸（poly-E）的序列可能通过其特殊的构象可塑性来适应染色质的动态拓扑结构。

此外，本研究在多种重要生理过程中发现了蛋白质-DNA相互作用的动态重编程现象。在细胞周期进程中，DNA复制起始因子表现出明显的结合时序性；在细胞分化过程中，关键转录因子的DNA结合谱系会发生系统性转变；而在应激响应中，DNA修复蛋白会形成瞬时的 “ 修复焦点 ” 结构。

综上所述，本研究开发了一种“零距离”光交联技术，可在活细胞中定量检测与DNA直接接触的蛋白质。通过收集人类乳腺癌细胞的DNA相互作用组数据，绘制了包含上千种DNA接触蛋白的图谱，并鉴定出数百个肽段-核苷酸交联位点，实现了单氨基酸分辨率的蛋白质-DNA界面定位。通过比较不同处理条件下DNA相互作用组的定量变化，重现了关键转录因子和DNA修复蛋白的招募过程，同时发现了可在分钟级别快速调控染色质可及性的限制因子。这项技术为以无假设方式探索基因组调控机制开辟了新途径，适用于多种生物体系。

制版人：十一

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