Nat Commun | 王晓钧团队解析禽流感病毒蛋白NS2在促进病毒聚合酶适应哺乳动物宿主中的分子机制

摘要：禽流感病毒的跨物种传播对人类健康构成了严重威胁。然而，大多数情况下，禽流感病毒从禽类到哺乳动物宿主的跨物种传播受到一定限制，其主要原因在于物种间的进化差异所带来的宿主种间屏障。长期以来观察到禽流感病毒负责病毒基因组复制的聚合酶在哺乳动物细胞中活性极低。2016

禽流感病毒的跨物种传播对人类健康构成了严重威胁。然而，大多数情况下，禽流感病毒从禽类到哺乳动物宿主的跨物种传播受到一定限制，其主要原因在于物种间的进化差异所带来的宿主种间屏障。长期以来观察到禽流感病毒负责病毒基因组复制的聚合酶在哺乳动物细胞中活性极低。2016年，英国科学家首次证实，哺乳动物和禽类ANP32A/B蛋白在氨基酸序列上存在显著差异，禽ANP32A蛋白具有一个33个氨基酸的插入，使其对禽流感病毒聚合酶具有高度支持活性，而哺乳动物ANP32A/B蛋白不具备此特征，无法有效支持禽流感病毒聚合酶的活性，从而限制了禽流感病毒在哺乳动物细胞中的复制（Long JS et al., Nature，2016）。

2019年，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所王晓钧团队首次利用ANP32A/B双基因敲除细胞系证实了不同物种ANP32A/B蛋白对A型流感病毒聚合酶的支持活性，揭示了哺乳动物ANP32A和ANP32B蛋白在支持A型流感病毒聚合酶功能方面具有一致性，而禽类ANP32B蛋白在129/130两个关键氨基酸位点上存在天然失活突变，导致其成为一个失活分子，无法支持A型流感病毒聚合酶的功能，因此该位点成为基因编辑抗流感鸡的优良靶点（Haili Zhang et al., JVI, 2019）。2020年，该研究团队进一步发现，与其他哺乳动物ANP32A/B蛋白相比，猪ANP32A蛋白在106/156两个关键氨基酸位点上存在特异性差异。这些差异使得猪ANP32A蛋白能够在一定程度上支持禽流感病毒聚合酶的功能。这一发现从宿主因子ANP32的角度解释了猪作为“中间宿主”在流感病毒“混合器”中的作用机制（Haili Zhang et al., PLoS Path, 2020）。同年，该团队还发现，B型流感病毒的聚合酶功能也依赖于宿主因子ANP32A/B/E蛋白。同时，该研究还表明，禽类ANP32A/B蛋白对B型流感病毒聚合酶活性的支持效率较低，这也为禽类极少自然感染B型流感病毒提供了分子机制的解释（Zhenyu Zhang et al., PLoS Path, 2020）。

尽管哺乳动物ANP32A/B蛋白不能有效支持禽流感病毒聚合酶的活性，从而限制了禽流感病毒的跨物种传播，但部分亚型的禽流感病毒仍能够突破这一限制，在哺乳动物细胞中建立有效感染。然而，这一潜在的分子机制仍未完全明了。近年来，王晓钧团队在该领域的研究取得了重要进展，发现了禽流感病毒跨物种传播突破宿主限制并成功建立感染的两种新机制。第一种机制是，禽流感病毒在跨物种传播到哺乳动物宿主时，包装有禽ANP32A的病毒颗粒可以促进病毒在哺乳动物细胞中的早期复制，从而提高获得适应性突变的病毒总量，加速禽流感病毒对哺乳动物宿主的适应过程（Lei Na et al., Science Advances, 2024）。第二种机制是，团队与陈化兰院士团队合作，首次发现禽流感病毒的非结构蛋白NS2能够利用其自身的SUMO互作位点（SUMO-interacting motif，SIM），帮助病毒聚合酶适应哺乳动物ANP32A/B蛋白，从而增强病毒对哺乳动物宿主的适应性，推动禽流感病毒的跨物种传播（Liuke Sun et al., Science Advances, 2023）。然而，关于“禽流感病毒非结构蛋白NS2如何通过SIM位点促进病毒聚合酶适应哺乳动物ANP32A/B蛋白”这一关键科学问题，仍然需要进一步探索。

近日，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所王晓钧团队在 Nature Communications 上发表了题为Human ANP32A/B are SUMOylated and utilized by avian influenza virus NS2 protein to overcome species-specific restriction 的研究论文。该研究揭示，禽流感病毒非结构蛋白NS2通过携带的SIM位点，特异性地识别并结合SUMO化修饰的人ANP32A/B蛋白，从而促进人ANP32A/B蛋白对禽流感病毒聚合酶活性的支持，增强病毒对人细胞的适应性，最终推动禽流感病毒的跨物种传播。

作者首先通过免疫共沉淀（Co-IP）、双分子荧光互补（BiFC）和邻近连接实验（PLA）等技术验证了NS2与人ANP32A/B蛋白在细胞核中存在直接的相互作用。进一步研究发现，人ANP32A/B蛋白能够发生SUMO1/2/3介导的SUMO化修饰，而这一过程受到E3 SUMO连接酶PIAS2α和去SUMO化酶SENP1的调控。值得注意的是，禽流感病毒感染显著促进了人ANP32A/B蛋白的SUMO化修饰水平。随后，作者确认NS2与人ANP32A/B蛋白的结合符合经典的SIM-SUMO互作模式，即NS2上的SIM识别并结合人ANP32A/B蛋白上的SUMO分子。

接下来，作者通过聚合酶活性实验和病毒复制实验进一步证明了SIM-SUMO介导的NS2与人ANP32A/B的结合对于NS2发挥促进禽流感病毒聚合酶适应人ANP32A/B的功能至关重要。进一步研究发现，NS2-SIM能够特异性地识别并结合人ANP32A蛋白的K68/K153位点和人ANP32B蛋白的K68/K116位点上发生的SUMO化修饰。有趣的是，破坏人ANP32A蛋白的K68/K153位点或人ANP32B蛋白的K68/K116位点，并不会影响人ANP32A/B蛋白的总体SUMO化修饰，且破坏人ANP32A/B蛋白上其他SUMO化位点也不影响其与NS2的结合以及NS2的功能。这些结果表明，只有特定位点的SUMO化修饰才能被NS2-SIM识别并结合。

最后，作者通过Co-IP实验进一步验证，SIM-SUMO介导的NS2与人ANP32A/B的相互作用能够通过正向调控禽流感病毒核糖核蛋白（vRNP）复合体与ANP32A/B蛋白的结合以及vRNP的组装能力，从而增强人ANP32A/B蛋白对禽流感病毒聚合酶活性的支持作用。

综上所述，基于前期研究中发现的NS2通过SIM促进禽流感病毒聚合酶适应哺乳动物ANP32A/B蛋白的作用，本研究进一步揭示了NS2-SIM发挥这一功能的分子机制。具体而言，当禽流感病毒跨物种传播至人类细胞时，人ANP32A/B蛋白的SUMO化修饰水平上调，随后通过经典的SIM-SUMO互作模式招募NS2。被招募的NS2促进人ANP32A/B蛋白与禽流感病毒vRNP的结合，增强vRNP的组装能力，从而提高了禽流感病毒聚合酶对人ANP32A/B蛋白的适应性。该发现为我们深入理解禽流感病毒如何突破物种屏障、适应不同宿主提供了新的线索，也为未来开发抗病毒疗法提供了潜在的靶点。