摘要：在人类母乳中发现的 200 多种寡糖里，6′-唾液酸-N-乙酰乳糖胺（6′-SLN）和 3′-唾液酸-N-乙酰乳糖胺（3′-SLN）是两种具有重要生物活性的稀有组分，它们够显著影响神经发育所必需的关键脑代谢物和神经递质。然而，这两种分子在天然母乳中含量极微，牛
在人类母乳中发现的 200 多种寡糖里，6′-唾液酸-N-乙酰乳糖胺（6′-SLN）和 3′-唾液酸-N-乙酰乳糖胺（3′-SLN）是两种具有重要生物活性的稀有组分，它们够显著影响神经发育所必需的关键脑代谢物和神经递质。然而，这两种分子在天然母乳中含量极微，牛奶来源也有限且分离成本高昂。长期以来，缺乏高效、低成本的合成方法严重阻碍了对其功能的深入研究和潜在应用开发。
面对这一挑战，来自中国科学院过程工程研究所的团队创新性地提出了“一锅两步多酶法”的全新策略，高效经济地合成了这两种人乳寡糖——6′-SLN和 3′-SLN ，为进一步开发母乳寡糖类药物提供了新途径。该成果以“Highly Efficient and Economical One-Pot Two-Step Multienzymatic Synthesis of 6′/3′-Sialyllactosamine from In Situ-Produced N-Acetyllactosamine”为题发表在上 Journal of Agricultural and Food Chemistry。
研究的核心在于颠覆性的流程设计：第一步利用团队前期开发的低成本多酶级联系统（包含 NTP 再生循环），在反应器中原位合成关键前体 N-乙酰乳糖胺（LacNAc）；第二步无需分离纯化中间产物，直接在同一个反应锅中加入新的酶系，将粗制 LacNAc 混合液转化为目标产物 6′-SLN 或 3′-SLN。这种设计彻底摒弃了中间产物纯化步骤，为大幅降本奠定基础。
为了实现第二步的高效合成，团队利用廉价的六偏磷酸盐（polyP₆）和聚磷酸激酶（PPK3）构建了一个 5′-三磷酸胞苷（CTP）循环“充电宝”。传统工艺中，合成每个唾液酸化分子都需消耗昂贵的 CTP。而新策略中，PPK3 酶能以 polyP₆ 为磷酸供体，将反应副产物胞苷二磷酸（CDP）重新磷酸化再生为 CTP，同时焦磷酸酶（PPA）将副产物焦磷酸水解为无机磷酸驱动反应。这一循环使 CTP 用量锐减，从源头上掐断了主要成本来源。实验证明，以商品化 LacNAc 为原料时，结合该再生系统，6′-SLN 和 3′-SLN 收率分别高达 96.7% 和 98.2%，显著优于无再生系统的 94.1% 和 93.6%。
图 | 多酶级联合成 6′-SLN/3′-SLN 的 NTP 再生机制
然而，当团队雄心勃勃地尝试直接使用第一步产生的、未经纯化的粗制 LacNAc 混合液（内含高浓度磷酸盐等杂质）进行第二步合成时，却遭遇了迎头一击：6′-SLN 和 3′-SLN 收率暴跌至仅 36.8% 和 25.7%。关键瓶颈浮出水面——粗制混合液中的磷酸盐杂质强力螯合了反应必需的镁离子（Mg²⁺）。参与第二步合成的核心酶（如 CMP-唾液酸合成酶 NmCSS、唾液酸转移酶 Pd2,6ST/PmST1）均高度依赖 Mg²⁺ 发挥活性。Mg²⁺ 被“锁住”，酶活便大幅受抑。
针对这一致命难题，团队通过两项精巧优化实现了破局。第一招是分批投料策略。虽然 polyP₆ 是再生系统的必需“燃料”，但一次性加入高剂量（60 mM）会加剧对 Mg²⁺ 的抢夺。团队创新性地将 60 mM polyP₆ 分三次投入。此策略有效缓解了初始高浓度 polyP₆ 对 Mg²⁺ 的瞬时“劫持”，使酶活性得以维持，将 6′-SLN 收率从单次投料的低位提升至 76.8%；第二招是精准锁定 pH 值。传统酶法多在 pH 8.5 进行，但团队发现该条件下磷酸盐易与 Mg²⁺ 形成沉淀，加剧离子匮乏。通过系统测试 pH 6.0-9.0 的影响，惊喜地发现在 pH 7.0 时收率达到峰值。在此 pH下，磷酸盐沉淀 Mg²⁺ 的倾向最小，最大程度保障了游离 Mg²⁺ 浓度供酶使用，同时关键酶活性仍保持充分。当两项优化联用，6′-SLN 和 3′-SLN 的收率跃升至 95.0% 和 94.8%，与使用昂贵纯品 LacNAc 的效果持平，却彻底省去了前体纯化的成本和步骤。
为验证工业化潜力，团队在 5 L 规模反应器中进行了终极考验。采用优化条件后，结果令人振奋：6′-SLN 收率达 96.1%，产量 259.2g；3′-SLN 收率 92.3%，产量 248.7g。值得一提的是，产物与残留 LacNAc 之间存在约 314 Da 的分子量差，这为后续工业级纯化（如纳滤技术）提供了天然便利。
该项研究突破了唾液酸化人乳寡糖高效合成的关键技术与成本瓶颈，首创的“一锅两步多酶法”整合了 NTP 再生循环系统，将昂贵 CTP 消耗降至最低；独创性的分批投料和 pH 优化策略，成功驯服了粗制前体中的抑制性杂质，省去了高成本纯化步骤；最终在 5L 规模、80 mM 高浓度下实现近 260 克级产出，收率超 92%。这不仅为 6′-SLN 和 3′-SLN 的规模化生产铺平道路，极大降低其作为抗病毒药物或脑健康配料的应用门槛，也为其他高附加值唾液酸化寡糖（如 3′-唾液酸乳糖、6′-唾液酸乳糖）的绿色生物制造提供了可复用的技术范式和核心酶库资源。
参考链接：
1.Jiao R, Peng X, Wang B, Du Y, Qian EW, Li J. Highly Efficient and Economical One-Pot Two-Step Multienzymatic Synthesis of 6'/3'-Sialyllactosamine from In Situ-Produced N-Acetyllactosamine. J Agric Food Chem. 2025 May 29. doi: 10.1021/acs.jafc.5c00395. Epub ahead of print. PMID: 40440090.
免责声明：本文旨在传递合成生物学最新讯息，不代表平台立场，不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准。本文也不是治疗方案推荐，如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。
来源：生辉SciPhi
