摘要：这项研究借鉴了柏林患者的治愈经验，该患者被全球公认为第一例通过干细胞移植治愈HIV的患者。研究者们通过CRISPR/Cas9技术对人类造血干祖细胞（HSPC）进行CCR5基因编辑，成功实现了90%以上的CCR5编辑，并且移植后的细胞能够正常进行造血，生成缺乏C
近日，《自然通讯》上发布了一篇名为《人类造血干细胞中的高频率CCR5编辑可保护异种移植小鼠免受 HIV 感染》的文章。
这项研究借鉴了柏林患者的治愈经验，该患者被全球公认为第一例通过干细胞移植治愈HIV的患者。研究者们通过CRISPR/Cas9技术对人类造血干祖细胞（HSPC）进行CCR5基因编辑，成功实现了90%以上的CCR5编辑，并且移植后的细胞能够正常进行造血，生成缺乏CCR5的T细胞，从而使小鼠对HIV感染具有免疫抵抗力。
实验还发现，当CCR5编辑率低于90%时，保护效果会逐渐减弱，而在编辑率超过90%时，能有效防止HIV感染和复制。
这些结果表明，利用CRISPR技术对HSPC进行高频CCR5编辑，不仅可行，而且能够有效抵抗HIV感染，为HIV的治愈研究提供了新的思路。
01造血干细胞移植
虽然现有的抗HIV治疗可以控制病毒，但不能治愈HIV，因此仍在寻找新的治愈方法。几位患者通过接受带有CCR5Δ32/Δ32基因突变的造血干细胞移植，成功实现了HIV长期缓解，这证明HIV治愈是可能的。不过，由于这类移植的复杂性和风险，难以广泛应用。
基因编辑技术，尤其是CRISPR/Cas9的进步，带来了新的希望。通过在患者自己的造血干细胞中编辑CCR5基因，可以避免异体移植的风险，并实现自体移植。但要高效编辑CCR5基因仍然存在挑战，尤其是在保持细胞的多能性和移植能力方面。
研究表明，要有效阻止HIV复发，需要较高频率的CCR5基因编辑，至少达到90%。
文中研究通过CRISPR/Cas9成功在成人的造血干细胞中实现了超过90%的CCR5编辑，且这些编辑后的细胞保持了正常的造血能力，并能有效抵抗HIV感染。这为未来自体CCR5基因编辑移植治疗HIV提供了重要的研究基础。
02研发CCR5编辑基因
发现流程识别出最佳CCR5特异性引导RNA
研究人员通过计算机预测和体外筛选相结合，找到了能高效编辑CCR5基因的最佳引导RNA（gRNA）。最初，他们计算出123个可能在CCR5基因上造成双链断裂的gRNA，并排除了15个可能与其他基因结合的gRNA。
剩下的108个gRNA在实验中与Cas9蛋白结合，测试了它们在成人动员的造血干细胞中的编辑效果。结果发现，其中11个gRNA的编辑效率超过30%，且不与CCR2基因相似，因此被选中进行进一步优化。
在进一步测试中，研究团队通过电穿孔技术进行编辑，并通过深度测序检查可能的非靶向编辑（即不在目标基因上的错误编辑）。
结果显示，除一个gRNA（TB8）外，其它三个gRNA几乎没有发生非靶向编辑。最终，他们确定了四个高效且安全的gRNA，并选择这些作为进一步实验的基础。
最佳CCR5靶向gRNA显著减少人类T细胞表面的CCR5表达
研究人员测试了四种最佳的gRNA（TB7、TB8、TB48和TB50），看看它们是否能够有效编辑CCR5基因，并影响T细胞表面的CCR5蛋白表达。
结果显示，所有四种gRNA在T细胞中的编辑效率都很高，介于52%到70%之间，并且都能有效降低CD4+和CD8+ T细胞表面CCR5的表达（CCR5+）。相比之下，使用假“编辑”gRNA时，CCR5+细胞的比例明显减少。
接着，研究团队将TB48和TB50结合使用，采用“双重引导”方法，模拟CCR5Δ32突变的效果。这个方法也能强效编辑CCR5基因，并降低CCR5的表达。值得一提的是，这些编辑在培养10天后依然有效，且没有观察到未编辑细胞的扩增或CCR5表达变化。
最后，研究人员通过AUC分析量化了CCR5+细胞频率的变化，发现TB48、TB50以及双重引导的组合在减少CCR5+ CD4+和CD8+ T细胞的频率方面，比TB7和TB8更有效。
CCR5编辑使人类CD4+ T细胞具备抗HIV的能力
为了验证CCR5编辑对抗HIV的效果，研究人员对来自三位不同供体的外周血单核细胞（PBMCs）进行了高剂量的HIV挑战，使用了不同的gRNA编辑方法。结果显示，与使用假GFP编辑的CD4+ T细胞相比，所有CCR5编辑的CD4+ T细胞的感染率显著降低。
特别是在测试的三位供体中，使用TB48、TB50和TB48+TB50双重引导进行CCR5编辑的细胞，在6天后的HIV感染程度与假感染对照组几乎相同。
通过对感染细胞频率和感染负担的分析，研究发现，TB48、TB50或TB48+TB50双重引导编辑的细胞，HIV感染频率明显低于TB7和TB8编辑的细胞。此外，CCR5+ CD4+ T细胞频率的降低与HIV感染频率的减少紧密相关。
这些结果表明，CCR5编辑能够有效赋予CD4+ T细胞抗HIV的能力，并且TB48+TB50双重引导方法具有很大的研究潜力。
CCR5编辑不影响人类CD34+ HSPC的长期移植和造血功能
为了评估高频CCR5编辑对造血干细胞（HSPC）的影响，研究人员使用TB48和TB50这两种gRNA与Cas9蛋白对三位健康成人的动员造血干细胞进行了电穿孔。
编辑后48小时，结果显示，三位供体的CCR5编辑效率高达91%至97%。电穿孔后的细胞存活率超过95%，并且不同编辑条件下，细胞的回收率相当。
在单细胞实验中，研究发现，无论是使用假编辑（GFP gRNA）还是双重gRNA（TB48+TB50）的编辑，造血干细胞的克隆数目和谱系组成没有显著差异。随后，研究人员将编辑后的HSPC移植到免疫缺陷小鼠中，观察其长期移植效果。
虽然在移植后的一个月内，使用CCR5编辑的HSPC的小鼠血液中人类CD45+细胞的数量较低，但随着时间的推移，这一差异逐渐消失。
最重要的是，无论是未编辑的、假编辑的，还是CCR5编辑的HSPC移植小鼠，红系、髓系和淋巴系人类细胞的分布和比例相似，表明电穿孔过程或高频CCR5编辑不会影响HSPC的造血潜力。
CCR5缺失的人类造血异种移植的稳定性
研究人员评估了高频CCR5编辑对人类造血干细胞（HSPC）移植的稳定性和功能性影响。他们量化了移植了超过90% CCR5编辑HSPC的小鼠中，髓系细胞（CD33+）和T细胞（CD3+）中CCR5+细胞的变化。
结果显示，这些小鼠的髓系细胞和T细胞几乎没有CCR5表达，明显低于移植了未编辑或假编辑（GFP）HSPC的小鼠。
在6个月的跟踪中，移植了CCR5编辑HSPC的小鼠中，髓系细胞中CCR5+细胞的比例低于2%，而对照组小鼠为约30%。另外，T细胞也几乎没有CCR5表达，表明这些细胞对HIV的易感性大大降低。
在另一项独立的研究中，使用来自另一位健康供体的HSPC进行类似的编辑和移植，得到了相似的结果。
这表明，使用双重gRNA方法高效编辑CCR5的HSPC，可以形成几乎不含CCR5表达的人类造血移植物，基本实现了CCR5Δ32/Δ32突变的效果，提供了HIV防治的新方向。
CCR5 编辑的频率决定了HIV感染的风险
CCR5编辑的异种移植小鼠对HIV感染具有免疫屏障
在移植了TB48 + TB50双重gRNA CCR5编辑HSPC的小鼠中，CCR5表达的CD4+ T细胞显著减少，表明这种移植可能具备对HIV的抗性。
为了验证这一点，研究人员用高剂量的CCR5趋向性HIV（HIVJRCSF）对小鼠进行挑战，并将CCR5编辑小鼠与假编辑（GFP gRNA）对照组进行比较。
结果显示，所有假编辑小鼠在挑战后都被感染，且血浆中的HIV RNA水平在2周内大幅上升，超过了10^3拷贝/mL。而CCR5编辑的小鼠则有效抵抗了HIV感染，甚至在进行五倍剂量的后续挑战后仍未感染。
在对照小鼠中，HIV感染导致CD4+ T细胞快速减少，而CCR5编辑的小鼠则没有这种细胞丧失。通过数字滴度PCR（ddPCR）检测，研究人员在CCR5编辑小鼠中没有发现低水平或非生产性HIV感染的证据，这些小鼠在挑战后5周的尸检中，淋巴结组织未检出HIV整合DNA。
为了确保保护效果确实来自CCR5编辑而非编辑过程的副作用，研究人员用CCR5编辑小鼠再次进行挑战。
尽管这些小鼠成功抵抗了之前的HIVJRCSF感染，但当用替代共受体CXCR4的HIV株（HIVNL43）进行挑战时，小鼠成功感染并表现出强烈的HIV病毒血症。这证明CCR5编辑小鼠的抗HIV效果是特定于CCR5表达去除的。
这些结果表明，通过高频CCR5编辑的人类造血干细胞（HSPC）移植，可以有效重建CD4+ T细胞，并使其对CCR5趋向性HIV产生免疫保护。
CCR5编辑HSPC的不同剂量对HIV感染及其病理的影响
在前面的研究中，移植了超过90% CCR5编辑人类造血干细胞（HSPC）的小鼠能完全抵抗CCR5趋向性HIV的挑战。但在实际临床中，可能会遇到CCR5编辑频率较低或者移植成功率较低的情况。
为了评估较低频率CCR5编辑的保护效果，研究人员在免疫缺陷小鼠中进行了实验，移植了不同剂量的CCR5编辑HSPC，并将其与假编辑（GFP gRNA）细胞混合，组成不同的移植组合。
这项研究使用了NBSGW小鼠，这种小鼠的突变可以避免强度全身照射，从而提高人类造血干细胞（HSPC）的移植效果。
研究设置了五个组，分别接受了100%、75%、50%、25%和0%剂量的CCR5编辑细胞。结果显示，移植后，CCR5编辑的频率在不同组间有所不同，分别为26%、54%、69%和96%。
与此同时，移植的CCR5编辑细胞量与外周血中CD33+髓系细胞和T细胞上CCR5表达的比例一致。
接下来，这些小鼠每周接受高剂量CCR5趋向性HIV（HIVJRCSF）挑战，持续8周，以评估不同CCR5编辑剂量的保护效果。
结果显示，CCR5编辑频率最低（26%）的小鼠组对HIV的易感性与对照组相同，所有小鼠都感染了HIV。而随着CCR5编辑剂量的增加，保护效果逐渐增强。与前期研究一致，编辑比例最高（96%）的组在8次挑战中都未感染，表现出完全的保护效果。
通过生存曲线分析，研究人员发现，CCR5编辑频率最低的组（26%）与对照组感染风险没有显著差异，挑战中的感染风险为0.28。
而CCR5编辑比例为54%的组感染风险降低了45%（0.16），但这一变化未达到统计学显著性。相比之下，CCR5编辑比例为69%和96%的两组则表现出了显著的保护效果，感染风险分别降低了82%（0.051）和100%（完全免疫）。
CCR5编辑对HIV感染风险的影响及其机制模型
研究人员随后分析了所有小鼠的HIV感染数据和CCR5编辑分布，并建立了一个模型，估算CCR5编辑频率对感染风险的影响。根据该模型，CCR5基因编辑超过98%的小鼠需要接种超过100次才能感染HIV。
为了更准确评估感染风险，研究人员根据每只小鼠的实际CCR5编辑频率，将它们分成五个组。结果显示，CCR5编辑频率最低的组（0–40%）的小鼠感染率较高，而随着编辑频率增加，感染率逐渐下降。
除了CCR5编辑对HIV感染的保护作用，研究还考虑了CCR5表达细胞减少对病毒载量的影响。研究人员认为，随着CCR5阴性HIV耐受性CD4+ T细胞比例的增加，靶细胞数量下降，最终可能阻止HIV传播，这个现象被称为“传播屏障”。
分析结果显示，CCR5编辑较高的小鼠病毒载量较低，未感染的动物数量增加。不过，考虑到传播屏障机制后，模型的拟合效果并没有显著改善，因为在高CCR5编辑水平下，只有少数小鼠可能会感染。
03结论
这项研究基于柏林患者的成功经验，探讨了使用CRISPR/Cas9技术编辑动员的CD34+ HSPCs中的CCR5基因，以复制CCR5Δ32/Δ32的保护效果，推动自体干细胞移植（HSCT）作为治疗HIV的一种广泛应用方法。
研究发现，使用两种高效引导RNA可以实现超过90%的CCR5编辑，同时不会影响干细胞的造血潜力。这表明，CRISPR/Cas9基因编辑有望复制柏林患者等的成功，并为更广泛的自体HSCT方法提供了可能。
研究表明，足够高频的CCR5编辑（大于90%）能有效防止HIV感染，并产生显著的保护效果。实验中，高频CCR5编辑的HSPC移植能够重建一个对HIV免疫的移植物，且不会显著影响HSPC的长期植入潜力。
尽管在高频编辑组中，短期内移植的人类细胞量有所减少，但这一差异在8周后消失，支持了高频编辑对长期造血潜力的影响非常小。此外，研究还发现，较低频率的CCR5编辑（如低于90%）虽然能降低感染风险，但不能完全阻止HIV感染。
在不同频率的CCR5编辑下，研究构建了一个模型，预测CCR5编辑频率如何影响ART停药后HIV再激活的风险。
模型预测，90%的CCR5编辑频率能推迟病毒反弹，而98%以上的编辑频率能推迟至少两个月的病毒反弹。更高频率的CCR5编辑不仅减少了感染风险，还降低了病毒的复制水平，从而为治疗策略提供了“传播屏障”。
特别值得注意的是，研究预测，当CCR5编辑频率达到87.5%时，靶细胞的数量会减少到病毒无法有效复制的水平，从而无法维持持续的感染。
这表明，高频CCR5编辑可能有助于阻止ART停药后HIV的再激活，避免病毒扩增，尤其是在缺乏HIV特异性免疫的情况下。
该研究为基因编辑在HIV治疗中的应用提供了重要数据，证明高频CCR5编辑的HSPC移植能够有效阻止HIV感染并延迟病毒复发。这也为基于自体干细胞移植（HSCT）的HIV治愈策略提供了可行路径。
随着CRISPR/Cas9技术效率提升及安全性得到认可，未来自体HSCT有望成为治疗HIV的新选择。此外，相关技术在治疗镰状细胞病和β-地中海贫血等遗传病的应用也为未来HIV治疗提供了有力支持。
注释：
CCR5 (C-C chemokine receptor type 5) C-C趋化因子受体5：CCR5是HIV病毒进入细胞的通道，成为抗HIV治疗的关键靶点。
HSPC (Hematopoietic Stem and Progenitor Cells) 造血干细胞及其前体细胞：HSPC是所有血液细胞的来源，能自我更新并分化成不同血细胞。它们在血液病治疗中起着重要作用。
HSCT (Hematopoietic Stem Cell Transplantation) 造血干细胞移植：HSCT是一种通过移植健康造血干细胞治疗血液病的方法。
gRNA (guide RNA) 引导RNA：gRNA是CRISPR技术中的RNA分子，帮助Cas9蛋白准确切割目标DNA，实现基因编辑。
Cas9 (CRISPR-associated protein 9) CRISPR相关蛋白9：Cas9是一种酶，在CRISPR基因编辑中负责剪切DNA，帮助实现基因修改。
CD34+ (Cluster of Differentiation 34 positive) CD34阳性：CD34阳性是造血干细胞的标志，重要于血液细胞的生成与血液病治疗。
NBSGW (Nonobese diabetic severe combined immunodeficient (NOD/SCID) with a common gamma chain mutation) 非肥胖型严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠，带有共同伽玛链突变：NBSGW小鼠是一种免疫缺陷小鼠，常用于免疫研究和基因治疗实验。
文章标题：High frequency CCR5 editing in human hematopoietic stem progenitor cells protects xenograft mice from HIV infection
作者：Claiborne, D.T., Detwiler, Z., Docken, S.S. et al.
DOI：10.1038/s41467-025-55873-3
编译：松鼠哥
来源：柴犬说科学