适配子如何精准定位？水凝胶里藏着3D图案密码，最小才2微米！

摘要：大家好！在生物医学领域，将生物受体与生物相容性基质结合对于推进疾病建模、药物筛选和生物研究中的体外微生理系统至关重要。研究团队提出了在水凝胶内实现高分辨率、多路复用适配子图案化的策略，成功创造出迄今报道的最小 3-D 适配子特征，约 2 微米。

大家好！在生物医学领域，将生物受体与生物相容性基质结合对于推进疾病建模、药物筛选和生物研究中的体外微生理系统至关重要。研究团队提出了在水凝胶内实现高分辨率、多路复用适配子图案化的策略，成功创造出迄今报道的最小 3-D 适配子特征，约 2 微米。

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一、研究背景

（一）水凝胶的基本特性与分类

水凝胶是多功能生物材料，具有亲水性的 3-D 聚合物网络，能够吸收大量水分，广泛应用于生物医学领域。它们主要分为天然和合成两大类，其中合成水凝胶如聚丙烯酰胺、聚乙二醇和聚乙烯醇（PVA）在化学可调性和机械强度方面具有显著优势。

（二）基于光的交联策略与 nPVA 水凝胶的优势

在合成水凝胶的各种交联策略中，基于光的化学方法，如自由基诱导的链增长聚合和硫醇-烯“点击”反应，能够实现对机械性能的精确时空控制，同时也便于通过凝胶后共轭或原位共聚合实现生物受体的整合。

降冰片烯功能化的聚乙烯醇（nPVA）水凝胶因其可调性、生物相容性、稳定性和化学修饰潜力，在生物打印、组织工程和再生医学中日益受到关注。其光学透明性使其非常适合作为生物墨水和基于光的图案化应用，并且与各种细胞具有细胞相容性。在本研究中，选择降冰片烯是因为它在硫醇-烯点击化学中具有高反应性，能够与含硫醇分子如二硫苏糖醇（DTT）高效交联，形成坚固且可调的水凝胶网络。

（三）适配子的特性与应用前景

适配子是能够结合从离子、小分子到肽、病毒甚至整个细胞等多种靶标的短单链 DNA 或 RNA 序列。与抗体等其他生物受体相比，适配子在体外从多达 10¹⁵个 DNA 序列的文库中设计和分离，能够在接近预期应用的条件下进行选择，如生理相关的 pH 和离子组成。由于其结合特定目标的能力，适配子在生物传感和分析物清除方面受到关注，并已被整合到水凝胶中以实现蛋白质的控释等功能。

（四）现有技术挑战与光基图案化方法的潜力

尽管取得了这些进展，但在实现适配子共轭的精确微尺度时空控制以及在单个水凝胶支架中多路复用不同适配子方面仍然存在挑战。传统方法如使用光可裂解连接子去除特定区域材料的减法方法存在局限性，无法实现多种分子的加法图案化。

而先进的基于光的图案化方法，如使用光掩模的紫外光图案化、数字光处理（DLP）和双光子聚合（2PP），为克服这些限制提供了潜在的解决方案。其中，双光子聚合能够实现亚微米分辨率的精确 3-D 图案化，支持纳米级的多路复用和时空控制功能化，是创建水凝胶内复杂功能特征的强大工具。

二、结果与讨论部分

（一）降冰片烯功能化聚乙烯醇的制备与表征

nPVA 的合成与验证

团队使用改进的方案合成了 nPVA，形成透明水凝胶，并通过质子核磁共振（¹H-NMR）光谱验证了合成材料。光谱显示了对应于 PVA 主链上降冰片烯取代的特征峰，计算出的取代度（DS%）为 10.4%，为交联和共轭提供了足够的烯烃。

水凝胶机械性能的调控

通过原位时间扫描光流变学来表征水凝胶的凝胶化和机械性能，监测刚度随时间的变化。通过改变硫醇：烯比例，展示了合成水凝胶的高度可调刚度，范围从约 600 Pa 到近 50 kPa，这种可调性使其能够匹配生理环境的刚度，并影响细胞行为等。例如，硫醇：烯比例为 1:10的低刚度凝胶近似于脑组织的机械性能，适合神经元培养；而较高刚度的组合物如 7:10 凝胶可用于更喜欢较硬环境的细胞。

光控交联与网孔尺寸分析

通过在 1:10 前体溶液上交替开关紫外光，证明了通过紫外光暂时控制交联反应的能力。流变学数据还用于估计水凝胶基质的网孔尺寸，范围从 6 到 23 纳米，非常适合适配子等小分子的扩散。

（二）水凝胶与适配子的功能化

适配子固定化的验证方法

水凝胶交联所用的硫醇-烯点击反应机制也可用于将各种生物分子共轭到 nPVA 支架中，只要生物分子含有可及的硫醇基团。通过 SYBR Gold 对适配子功能化的凝胶进行染色，这是一种 DNA 嵌入染料，嵌入 DNA 后荧光增强 1000 倍，从而可视化 DNA。

阴性对照实验与背景荧光分析

通过两种阴性对照评估功能化方案的有效性：一种是未进行紫外曝光的凝胶与适配子孵育，应导致可忽略的适配子固定；另一种是凝胶从未暴露于任何适配子。结果显示，与适配子孵育并暴露于紫外光的凝胶中观察到显著更高的荧光强度，验证了 DNA 的固定。为了确定背景荧光是否来自水凝胶内游离的 SYBR Gold 染料或未偶联的适配子，使用荧光标记的适配子进行实验，结果表明背景信号主要来自未结合的 SYBR Gold，需要大量洗涤去除。

FRAP 实验证实适配子固定

通过观察光漂白后的荧光恢复（FRAP）进一步验证了适配子的固定，光漂白区域在 1 小时内保持黑暗，没有荧光分子重新填充，支持 DNA 适配子被固定的事实。

（三）适配子整合水凝胶的性质研究

适配子对凝胶机械性能的影响

由于功能化后 nPVA 支架被适配子修饰，可能会影响凝胶的机械完整性，因此使用原位光流变学研究前体溶液的凝胶化行为。结果显示，有和没有 5μM 血清素适配子的刚度差异很小，表明高 DNA 浓度对交联或最终凝胶刚度影响很小。这是因为在 4:10凝胶中游离降冰片烯处于摩尔范围，而适配子浓度保持在低微摩尔水平，这种效应被减轻。

适配子功能验证的挑战与潜在方法

选择等温滴定量热法（ITC）来评估水凝胶基质中的靶标结合，但由于系统限制，在 ITC 中复制凝胶微环境具有挑战性，nPVA 的高粘度导致样品注射期间气泡形成，引入高变异性和噪声，结果不确定。一种可能的方法是竞争性荧光测定，即与适配子杂交的荧光标记互补 DNA（cDNA）链在小分子结合时被置换，但设计这样的测定存在挑战，包括确保置换的 cDNA 从水凝胶中有效扩散，以及最小化凝胶内的非特异性相互作用。

（四）通过光掩模进行适配子图案化

光掩模图案化的原理与效果

利用预成型凝胶内硫醇-烯点击反应的光响应性质，通过使用带有 50μm 点和条纹的光掩模，仅在暴露于紫外光的区域激活共轭。结果表明，适配子图案化可以高保真地实现，产生不同的暗点和条纹，暗区对应于被光掩模遮挡的区域，亮绿色区域代表暴露于紫外光的区域，其中适配子已偶联到凝胶。

图案深度限制与光吸收剂的作用

光掩模创建的暗条纹和点精确为 50μm 宽，与光掩模上的线条匹配，图案的轮廓清晰明确。正交视图显示图案深度约为 80μm，这可能是可实现的最大深度，受紫外光散射的限制。添加光吸收剂如酒石黄可改善图案化，使图案深入凝胶的深度增加三倍。

光掩模方法的局限性

这种方法需要为每个独特的图案创建新的光掩模，耗时且耗材料，并且尽管酒石黄有所改进，图案深度仍然限制在远低于 100μm 的垂直特征。

（五）通过数字光处理进行适配子图案化

DLP 技术的原理与优势

由于光掩模在生成任意图案方面缺乏灵活性和图案深度有限，采用数字光处理（DLP）生物打印设备，利用其内部的数字微镜装置，借助计算机辅助设计（CAD）程序生成任意紫外图案。

DLP 图案化的结果与参数影响

生成了三角形、圆形和正方形的不同绿色荧光图案，代表局部适配子的存在，CAD 模型与适配子图案之间的相似性证明了将任意 CAD 生成形式的生物分子可靠地图案化到凝胶基质上的可能性。在凝胶深度上观察到均匀的荧光，在 z 方向上延伸超过 200μm，这种增强的图案深度可能是由于 DLP 设备中使用 405nm 紫外光，与较短波长相比，散射较少。