易基因：关于用于干预研究的衰老生物标志物的专家共识声明含DNA甲基化/表观遗传时钟

摘要：衰老生物标志物在促进长寿的干预措施中是重要的结果指标。然而，对于哪些具体的生物标志物最适合用于人类干预研究，目前的共识有限。本研究旨在通过德尔菲法（Delphi Method，该方法用于在经验证据有限或存在争议时提供专家共识）建立专家共识，以确定用于干预研究的

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衰老生物标志物在促进长寿的干预措施中是重要的结果指标。然而，对于哪些具体的生物标志物最适合用于人类干预研究，目前的共识有限。本研究旨在通过德尔菲法（Delphi Method，该方法用于在经验证据有限或存在争议时提供专家共识）建立专家共识，以确定用于干预研究的衰老生物标志物。并探讨多种生物标志物在衰老研究中的应用，详细分析了其特性及专家共识。

研究通过在线平台进行了三轮德尔菲研究：

第一轮：专家小组成员提供候选衰老生物标志物的建议。第一轮邀请 460 位专家推荐生物标志物，116 人完成。第二轮：专家对500个初步陈述（是/否）进行投票，这些陈述涉及20个衰老生物标志物，87人完成。专家可以对那些他们认为自己没有专业知识的生物标志物进行弃权。第三轮： 60 人重新评估未达成共识的陈述，当有70%或以上的专家同意一个陈述/生物标志物时，就达成共识。

研究达成14个共识生物标志物，这些生物标志物可用于干预研究的结果测量：

在三轮中，有14个生物标志物达成了共识，这些生物标志物涵盖了生理（如胰岛素样生长因子1、生长分化因子-15）、炎症（如高敏C反应蛋白、白细胞介素6）、功能（如肌肉质量、肌肉力量、握力、起立行走测试、步速、站立平衡测试、虚弱指数、认知健康、血压）和表观遗传（如DNA甲基化/表观遗传时钟）领域。

研究摘要

研究结果

总共向专家组成员发送了460份邀请。共有150名成员（32%回应率）同意参与，其中116名（77%）完成了第一轮。87名小组成员（75%）完成了第二轮，60名（69%）完成了全部三轮。非临床医生（73%）多于临床医生，专家组成员中担任高级职位比例略高（42%），大多数居住在欧洲（65%）。各轮中小组成员特征没有差异（临床医生与非临床医生、职业阶段、所在国家，P>0.05）。

图1：流程和结果的流程图

在第一轮中，共提出了460个衰老生物标志物的建议，当按主要主题分类时，减少到341个。其中，20个生物标志物被提及≥10次。这些生物标志物在第二轮中由小组评估，包括：生理（胰岛素样生长因子1（IGF-1）、生长分化因子-15（GDF15）、葡萄糖、糖化血红蛋白（HbA1c）、胆固醇）、炎症（高敏C反应蛋白（hsCRP）、白细胞介素-6（IL-6））、功能（肌肉质量、肌肉力量、握力（HGS）、起立行走测试（TUG）、步速、站立平衡测试（SBT）、虚弱指数、认知健康、血压）以及遗传/表观遗传（端粒长度、DNA甲基化、表观遗传时钟）领域。

在第二轮中，20个潜在生物标志物中有14个达成了共识。由于缺乏一致意见，两个生物标志物被移除，四个生物标志物被带到第三轮进行重新评估（图2A）。作为适合的衰老生物标志物达成共识的生物标志物包括：IGF-1、GDF15、hsCRP、IL-6、肌肉质量、肌肉力量、HGS、TUG、步速、SBT、虚弱指数、认知健康以及DNA甲基化和表观遗传时钟（由于表观遗传时钟通常使用DNA甲基化数据，具有相似性，这两个在第三轮中合并为一个生物标志物）。小组成员之间达成少于50%一致意见的生物标志物，因此被移除进一步考虑的生物标志物胆固醇和葡萄糖。在第三轮中进一步评估并达成适度共识的生物标志物是TNF-α、HbA1c、血压和端粒长度。

在第三轮中，一个生物标志物（血压）达成了共识，三个生物标志物（TNF-α、HbA1c、端粒长度）在60名小组成员中达成少于70%的一致意见（图2B, C）。不推荐的生物标志物（≤50%一致意见）是葡萄糖和胆固醇；达成适度一致意见（51-69%一致意见）的生物标志物是TNF-α、HbA1c和端粒长度；推荐的生物标志物（≥70%一致意见）是IGF-1、GDF15、hsCRP、IL-6、肌肉质量、肌肉力量、HGS、TUG、步速、SBT、虚弱指数（例如Fried、Rockwood Mitnitski）、认知健康（例如蒙特利尔认知评估）、血压和DNA甲基化/表观遗传时钟。

图2：衰老潜在生物标志物

达成共识的 14 种生物标志物

通过德尔菲法的研究，最终达成共识的 14 种生物标志物涵盖了生理、炎症、功能和表观遗传等多个关键领域，它们各自具有独特的特性和在衰老研究中的重要意义。

胰岛素样生长因子 1（IGF-1）：在衰老研究中具有重要意义，其水平变化与衰老进程相关。在第二轮和第三轮的德尔菲研究中，对于它是否能预测功能方面优于实际年龄、是否具有机制验证性等问题，多数专家给予了肯定回答。例如，在预测功能方面，它可能参与调节身体的代谢和生长过程，与肌肉力量、骨密度等身体功能指标存在关联，能够在一定程度上反映衰老过程中身体功能的变化趋势，且在不同人群和组织中具有一定的普遍性。在临床应用方面，虽然其在临床验证上还存在一定的提升空间，但在一些研究中已被发现与老年人的健康状况和疾病风险相关，如心血管疾病、糖尿病等慢性疾病的发生发展可能与 IGF-1 水平的改变有关。在实际测量中，其采样相对容易，对参与者、研究人员和数据分析人员的遮蔽性较好，通常被认为是低负担、非侵入性或中度侵入性且成本较低的生物标志物，这使得它在大规模的衰老研究和临床实践中具有较高的可行性和应用潜力。生长分化因子 15（GDF15）：是一种与衰老密切相关的细胞因子。随着年龄的增长，其在体内的表达水平通常会发生变化，如在一些衰老相关的疾病或生理状态改变时，GDF15 的表达会显著上调。在德尔菲研究中，专家们普遍认为它适合作为中长期干预研究的生物标志物，这是因为其在衰老过程中的变化相对较为缓慢且稳定，能够反映出长期的生理状态改变。在功能特性方面，它在不同的细胞类型、器官和人群中具有一定的普遍性，能够反映衰老过程中的一些共同机制。例如，在心血管系统中，GDF15 可能参与调节心肌细胞的功能和代谢，与心脏的衰老和疾病发生相关；在代谢方面，它可能与脂肪代谢、胰岛素抵抗等过程存在联系。在实际应用中，GDF15 的测量具有较高的精确性和可靠性，采样过程相对简单，不需要复杂的设备和技术，且对参与者的负担较小。其在临床验证方面虽然还需要进一步的研究，但已经显示出与一些衰老相关疾病的关联性，如在慢性肾脏疾病、癌症等患者中，GDF15 水平往往会升高，这提示它可能作为这些疾病的潜在预后指标或治疗靶点。在成本方面，它通常被认为是低至中度成本的生物标志物，这使得其在临床实践和大规模研究中的应用具有一定的经济可行性。高敏 C 反应蛋白（hsCRP）：作为炎症标志物在衰老研究中占据重要地位。在衰老过程中，慢性炎症是一个重要的特征，而 hsCRP 能够敏感地反映体内炎症状态的变化。在德尔菲研究的多轮评估中，专家们对其在不同方面的特性进行了深入讨论。在适用性方面，它被认为适合用于中长期的干预研究，因为炎症在衰老过程中的积累是一个渐进的过程，hsCRP 能够持续监测这一变化趋势。在临床验证方面，hsCRP 已经在心血管疾病等领域得到了广泛的研究和应用，其与动脉粥样硬化、冠心病等疾病的发生发展密切相关，能够作为预测心血管疾病风险的重要指标之一。在实际测量中，hsCRP 的检测技术相对成熟，采样容易获取，对研究人员和数据分析人员的遮蔽性较好，且通常被认为是低负担、非侵入性或中度侵入性的生物标志物，这使得它在临床实践和研究中能够方便地进行检测和应用，为评估衰老过程中的炎症状态提供了有力的工具。白细胞介素 - 6（IL-6）：是一种关键的炎症细胞因子，在衰老相关的炎症反应中发挥着核心作用。随着年龄的增长，体内的炎症平衡会发生改变，IL-6 的水平常常会升高，它参与了多种衰老相关疾病的病理过程，如关节炎、心血管疾病等。在德尔菲研究中，对于 IL-6 在不同干预研究中的适用性，专家们认为它更适合中长期的干预研究，因为其在体内的作用是一个长期的、渐进的过程，短期的变化可能难以准确反映衰老的本质。在功能特性方面，IL-6 在不同的细胞类型和组织中广泛存在且具有重要的调节作用，能够反映出衰老过程中炎症网络的变化情况。在临床应用中，虽然它在临床验证方面已经有了一定的研究基础，但由于炎症反应的复杂性，其在特异性方面还存在一些争议，例如在一些非衰老相关的炎症疾病中，IL-6 也可能会升高，这就需要进一步的研究来明确其在衰老研究中的独特作用。在实际测量方面，IL-6 的检测相对较为方便，但在采样和数据解释方面可能需要一定的专业知识和技术，且在负担、侵入性和成本方面，它通常被认为是低至中度的，这使得它在衰老研究中仍然是一个重要的研究对象，但在应用时需要谨慎考虑其特异性问题。肌肉质量：肌肉质量是身体功能和健康的重要组成部分，在衰老过程中会逐渐下降，这种下降与身体的活动能力、代谢功能等密切相关。在德尔菲研究中，专家们一致认为肌肉质量适合作为中长期干预研究的生物标志物，因为肌肉质量的改变是一个相对缓慢的过程，需要一定的时间来观察干预措施对其的影响。在功能特性方面，肌肉质量能够直接反映身体的功能状态，如肌肉力量、耐力等，其在不同人群和身体部位具有一定的普遍性，但也会受到个体的生活方式、营养状况和遗传因素等的影响。在临床应用中，肌肉质量的评估已经有了多种成熟的方法，如双能 X 线吸收法（DXA）等，这些方法能够准确地测量肌肉质量，且采样过程相对简单，对参与者的负担较小。在实际研究和临床实践中，监测肌肉质量的变化可以帮助评估衰老过程中身体功能的衰退情况，以及干预措施对肌肉健康的改善效果，对于预防和治疗肌肉减少症等与衰老相关的疾病具有重要意义。肌肉力量：与肌肉质量紧密相关，是衡量身体功能的重要指标之一。在衰老过程中，肌肉力量的下降往往比肌肉质量的下降更为明显，且会对日常生活活动能力产生直接影响。在德尔菲研究的多轮评估中，专家们对肌肉力量的各项特性进行了详细分析。在干预研究适用性方面，肌肉力量适合作为中长期干预研究的生物标志物，因为通过锻炼、营养补充等干预措施来提高肌肉力量通常需要一定的时间才能观察到明显的效果。在功能特性方面，肌肉力量能够很好地反映身体的运动能力和功能状态，在不同的人群和年龄段中具有重要的意义，且与其他身体功能指标如平衡能力、步态速度等存在密切的关联。在临床验证方面，肌肉力量的评估已经成为许多临床研究和实践的重要内容，其在预测老年人跌倒风险、残疾发生率等方面具有重要的价值。在实际测量中，有多种方法可以评估肌肉力量，如握力测试、腿部力量测试等，这些方法简单易行，对参与者的负担较小，且具有较高的精确性和可靠性，能够方便地在临床和研究环境中应用，为评估衰老过程中身体功能的变化提供了重要的依据。握力：作为一种简单且常用的肌肉力量评估指标，在衰老研究中具有独特的地位。握力的大小与全身肌肉力量、身体功能状态以及营养状况等密切相关。在德尔菲研究中，专家们认为握力适合作为中长期干预研究的生物标志物，这是因为握力的变化能够在一定程度上反映出身体整体肌肉力量的改变趋势，且在不同的人群和环境中具有较好的稳定性和可重复性。在功能特性方面，握力不仅能够反映上肢肌肉的力量，还与身体的其他功能如平衡能力、活动能力等存在关联，是评估老年人身体功能的重要指标之一。在临床应用中，握力的测量非常方便，只需要简单的握力计即可进行，对参与者的负担极小，且在不同的临床环境和研究中都具有较高的可行性。在实际研究中，握力常常被用作评估衰老过程中肌肉功能变化的重要指标，以及预测老年人健康状况和疾病风险的重要依据，如在一些研究中发现，握力较弱的老年人更容易出现跌倒、残疾等不良健康事件，且与心血管疾病、认知功能障碍等疾病的发生风险相关。计时起立行走测试（Timed-Up-and-Go，TUG）：是一种综合评估身体功能的测试方法，主要反映了个体的移动能力、平衡能力和肌肉力量等多个方面的功能状态。在衰老过程中，这些身体功能会逐渐下降，而 TUG 测试能够有效地捕捉到这些变化。在德尔菲研究中，TUG 被认为适合作为中长期干预研究的生物标志物，因为它能够全面地评估身体功能的变化情况，且这些变化通常是在较长时间内逐渐发生的。在功能特性方面，TUG 测试具有较高的综合性，能够反映出个体在日常生活中的实际活动能力，在不同的人群和环境中具有一定的普遍性和适用性。在临床应用中，TUG 测试已经在老年医学、康复医学等领域得到了广泛的应用，其在评估老年人跌倒风险、功能独立性等方面具有重要的价值。在实际测量中，TUG 测试操作相对简单，只需要一定的空间和简单的设备，如椅子、计时器等，对参与者的负担较小，且能够快速地完成测试，为临床医生和研究人员提供了一种方便、有效的身体功能评估工具。步态速度：是衡量身体移动能力和功能状态的重要指标之一。在衰老过程中，步态速度会逐渐减慢，这与肌肉力量下降、平衡能力降低、神经系统功能衰退等多种因素有关。在德尔菲研究中，专家们对步态速度的各项特性进行了深入探讨。在干预研究适用性方面，步态速度适合作为中长期干预研究的生物标志物，因为改善步态速度通常需要通过长期的锻炼、康复治疗等干预措施来实现。在功能特性方面，步态速度能够反映出身体多个系统的综合功能状态，在不同的人群和环境中具有重要的意义，且与其他身体功能指标如步长、步频等存在密切的关联。在临床应用中，步态速度的测量已经成为许多临床研究和实践的重要内容，其在预测老年人跌倒风险、心血管疾病风险、认知功能障碍等方面具有重要的价值。在实际测量中，步态速度可以通过简单的计时和测量行走距离来计算，通常在平坦的地面上进行，对参与者的负担较小，且具有较高的精确性和可靠性，能够方便地在临床和研究环境中应用，为评估衰老过程中身体功能的变化提供了重要的依据。站立平衡测试：对于维持身体的稳定性和正常活动至关重要，在衰老过程中，由于肌肉力量、神经系统功能等的下降，站立平衡能力会逐渐受到影响。在德尔菲研究中，站立平衡测试被认为适合作为中长期干预研究的生物标志物，因为平衡能力的改善需要一定的时间和持续的干预。在功能特性方面，站立平衡测试能够直接反映个体的平衡功能状态，在不同的人群和环境中具有重要的意义，且与跌倒风险、身体活动能力等密切相关。在临床应用中，站立平衡测试已经在老年康复、神经康复等领域得到了广泛的应用，其在评估老年人跌倒风险、制定康复治疗方案等方面具有重要的价值。在实际测量中，有多种方法可以进行站立平衡测试，如单腿站立测试、闭目站立测试等，这些方法操作相对简单，对参与者的负担较小，且能够有效地评估个体的平衡能力，为临床医生和研究人员提供了一种重要的身体功能评估工具。虚弱指数：虚弱是衰老过程中的一种常见状态，虚弱指数能够综合评估个体的生理、心理和功能等多个方面的健康状况，反映出个体对疾病和不良健康事件的易感性。在德尔菲研究中，虚弱指数被认为适合作为中长期干预研究的生物标志物，因为虚弱状态的改变通常是一个渐进的过程，需要通过长期的干预措施如营养支持、运动锻炼、医疗管理等才能得到改善。在功能特性方面，虚弱指数能够全面地反映个体的健康状况，在不同的人群和环境中具有重要的意义，且与其他衰老相关的生物标志物和健康指标存在密切的关联。在临床应用中，虚弱指数已经在老年医学、慢性病管理等领域得到了广泛的应用，其在预测老年人住院风险、死亡率、生活质量等方面具有重要的价值。在实际测量中，虚弱指数的计算通常需要综合考虑多个因素，如身体功能、疾病史、认知功能、营养状况等，虽然计算过程相对复杂，但已经有了一些标准化的评估方法和工具，能够为临床医生和研究人员提供一种全面、有效的健康评估手段。认知健康：认知功能的衰退是衰老的重要表现之一，认知健康涵盖了记忆、注意力、思维能力、语言能力等多个方面。在德尔菲研究中，认知健康被认为是一个重要的衰老生物标志物，适合作为中长期干预研究的指标。这是因为认知功能的变化通常是一个缓慢的过程，受到多种因素如生活方式、遗传、环境等的长期影响。在功能特性方面，认知健康能够反映出大脑的功能状态，在不同的人群和年龄段中具有重要的意义，且与其他身体功能和健康指标存在相互影响。在临床应用中，已经有多种标准化的认知测试工具，如蒙特利尔认知评估量表（MoCA）、简易精神状态检查表（MMSE）等，这些工具能够有效地评估个体的认知功能状态，且在临床研究和实践中得到了广泛的应用。在实际测量中，虽然认知测试需要一定的专业知识和环境，但对于参与者的负担相对较小，且能够为早期发现认知功能障碍、预防痴呆等疾病提供重要的依据。血压：血压是心血管系统健康的重要指标之一，在衰老过程中，血压常常会发生变化，高血压是老年人常见的慢性疾病之一，与心血管疾病、肾脏疾病等的发生发展密切相关。在德尔菲研究中，血压被认为是一个重要的衰老生物标志物，适合作为中长期干预研究的指标。在功能特性方面，血压能够反映心血管系统的功能状态，在不同的人群和环境中具有重要的意义，且与其他衰老相关的生物标志物和健康指标如血脂、血糖、血管功能等存在密切的关联。在临床应用中，血压的测量已经非常普及，有多种测量方法和设备可供选择，且测量过程简单、快速，对参与者的负担极小。在实际研究和临床实践中，长期监测血压的变化可以帮助评估衰老过程中心血管系统的健康状况，以及干预措施对血压控制和心血管疾病预防的效果，对于老年人的健康管理具有重要意义。DNA 甲基化 / 表观遗传时钟：DNA 甲基化是一种重要的表观遗传修饰，在衰老过程中，DNA 甲基化模式会发生改变，表观遗传时钟就是基于 DNA 甲基化数据构建的一种能够预测生物年龄的工具。在德尔菲研究中，DNA 甲基化 / 表观遗传时钟被认为是一个重要的衰老生物标志物，适合作为中长期干预研究的指标。在功能特性方面，它能够反映出细胞和组织的衰老状态，在不同的人群和组织中具有一定的普遍性和稳定性，且与其他衰老相关的生物标志物和健康指标存在关联。在临床应用中，虽然 DNA 甲基化的检测技术相对较为复杂，需要专业的实验室设备和技术人员，但随着技术的不断发展，其在临床研究中的应用越来越广泛，例如在预测个体的衰老速度、疾病风险、寿命等方面具有潜在的价值。在实际研究中，DNA 甲基化 / 表观遗传时钟为深入理解衰老的分子机制提供了重要的工具，也为开发新的衰老干预策略提供了新的靶点和方向。

研究讨论

生物标志物应用分析：多数适合中长期干预，急性和短期干预适用性差；多数适用于虚弱和认知障碍者及现场环境，但部分有局限；多数不影响衰老速度、可推广、精确可靠，但部分如端粒长度有争议。

与其他研究比较：推荐的多为功能 / 生理标志物，与以往研究有异同，因专家专长、标志物特性及研究成熟度等因素。复合标志物受青睐，但最佳组合有待研究，还需考虑现场适用性、验证及早期测量等问题。

研究优势与局限

优势：采用德尔菲法科学汇集意见，成员多样、无偏，匿名且在线调查便捷，利于综合观点。

局限：仅用英语可能排除非英语专家；成员代表性有偏；定义可能影响结果，虽有局限但仍具价值。

表观遗传时钟检测推荐技术

简化基因组甲基化测序（RRBS）研究解决方案

简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。

为适应科研技术的需要，易基因进一步开发了可在更大区域内捕获CpG位点的双酶切RRBS(dRRBS)，可研究更广泛区域的甲基化，包括CGI shore等区域。

为助力适用低起始量DNA样本（5ng）量多维度甲基化分析，易基因开发了富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的甲基化靶向基因组测序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），实现了高灵敏度和微量样本复用检测，使其具有高度可扩展性，并适用于有限的样本和单个细胞基因组CG位点覆盖高达15M以上。

技术优势：

起始量：100ng gDNA；单碱基分辨率；多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%、测序区域针对高CpG调控区域，数据利用率更高；针对性强，成本较低；基因组CG位点覆盖高达10-15M，显著优于850K芯片。

应用方向：

RRBS/dRRBS/XRBS广泛应用于动物，要求全基因组扫描（覆盖关键调控位点）的：

队列研究、疾病分子分型、临床样本的甲基化 Biomarker 筛选复杂疾病及肿瘤发病机制等甲基化研究模式动物发育和疾病甲基化研究

技术参数

RRBS

DRRBS

cfDNA-RBS

Micro-RBS

sc-RBS

原理

MspI酶切+连接接头

多酶切+连接接头

CCGG邻近片段连接接头

样本要求

1μg

1ng

单细胞/1-10个细胞

测序数据量

10G

15G

20G

5XCG位点覆盖

10M

4-8M

易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化、cfDNA）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C、RNA与蛋白互作）、DNA与蛋白互作及染色质开放性技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900。

参考文献：

Perri G, et al. An expert consensus statement on biomarkers of ageing for use in intervention studies. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2024 Dec 21. pii: 7930267. doi: 10.1093/gerona/glae297. PubMed PMID: 39708300.R和生物医学：【文献】用于干预研究的衰老生物标志物的专家共识声明

研究通过在线平台进行了三轮德尔菲研究：

研究结果

达成共识的 14 种生物标志物

研究讨论

简化基因组甲基化测序（RRBS）研究解决方案

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