摘要：在现代医学研究中，类器官技术正逐渐揭开人类健康的奥秘。这些精心培养的微型器官不仅在实验室里复制了真实器官的复杂性，而且在个性化医疗和新药开发中显示出巨大潜力。然而，随着类器官技术的进步，确保其质量和有效性成为了一个紧迫问题。本文将带您深入了解类器官的世界，探讨
在现代医学研究中，类器官技术正逐渐揭开人类健康的奥秘。这些精心培养的微型器官不仅在实验室里复制了真实器官的复杂性，而且在个性化医疗和新药开发中显示出巨大潜力。然而，随着类器官技术的进步，确保其质量和有效性成为了一个紧迫问题。本文将带您深入了解类器官的世界，探讨科学家如何通过标准化流程来应对这些挑战，以及这一进程对我们未来健康可能产生的影响。
文章介绍
题目：活体生物库：类器官构建的标准化与挑战
杂志：中华医学杂志
影响因子：IF=7.5
发表时间：2024年12月
#1
研究背景
Background
在科研、技术和经济活动中，标准化管理是提高效率和秩序的关键。类器官技术作为一种模拟活体组织的模型，在近十年中发展迅速，因其能够复制原始组织的多种特征而被誉为“活体生物库”。这项技术在疾病建模、药物筛选和再生修复领域展现出巨大潜力，尤其在新药开发中变得日益重要。
传统的细胞培养和动物模型无法精确模拟人类生理，导致研究结果难以应用于人类。相较之下，类器官提供了一个更接近人体生理的模型，能更准确地模拟病理生理环境和药物效应。
随着类器官在生物医学研究中的广泛应用，确保其构建过程中的标准化操作和管理变得至关重要，这有助于保证产品质量和研究的可重复性。类器官构建的复杂性要求持续的研究和创新，包括高效指导干细胞分化、选择提供必要机械和功能特性的生物材料等。
本文综述旨在系统介绍类器官构建操作程序的标准化、实验室建设的标准化，以及已发布的相关标准化文件，并探讨该领域的挑战和未来发展方向。
#2
研究结果
Results
1.类器官的用途
生物制药工业迅速发展，对精确实验模型的需求增加。传统细胞系和动物模型如PDX在癌症研究中存在局限性，如基因组变异和缺乏免疫系统。类器官技术自2009年起被用于3D细胞培养，因其保留亲本组织的多种特性而受到重视，被称为“活生物库”。2022年底，FDA批准类器官作为动物实验的替代品，凸显其在药物开发中的重要性。类器官技术发展面临标准化挑战，涉及成体干细胞（ASC）和诱导多能干细胞（iPSC）/胚胎干细胞（ESC）衍生类器官。ASC衍生类器官对个性化医疗具有价值，而iPSC/ESC类器官能分化成多种细胞类型，反映胚胎发育。本文讨论了ASC类器官的标准化问题。
2.类器官构建标准化
类器官构建标准化涉及组织采集、3D细胞培养、传代、冷冻保存、复苏、废弃处理以及分子特征分析和质量控制等环节，确保类器官产品的质量与稳定性，促进技术产业化发展。制备过程中，每个步骤需遵循标准化操作程序，并在涉及人类生物样本时获得伦理委员会批准及供体知情同意，包括样本保存、科研使用、药敏试验和研究成果转化等（图1）。
图1
2.1 组织收集和预处理
在构建类器官时，需遵循人类生物库伦理要求，由专业医生收集新鲜人体组织样本，并在30分钟内处理。样本应不小于5×5 mm，立即放入含抗生素的DMEM/F12保存液中。若不能当日培养，需用含Y27632的保存液过夜。类器官培养应在24小时内开始。预处理包括彻底清洗组织，用含抗生素的PBS洗涤，切割后用PBS振荡洗涤，最后离心并丢弃浑浊液，继续洗涤三次。
2.2 类器官培养
消化酶和时间需根据组织类型调整。胃肠道等组织需在37℃下用含胶原酶和透明质酸酶的消化液处理直至组织消化成粘稠状。胃肠道组织、食管组织和肺组织消化时间约为1小时，肝脏30分钟，肾脏15分钟。消化后过滤并离心得到细胞球，加入DMEM/F12培养基与基质胶混合后接种于孔板中，37℃孵育后加入完全培养基培养，每3-5天换液，2周后可传代。
2.3 类器官传代
细胞培养两周后，使用TrypLETM Express酶将类器官消化成单细胞，再重悬于与Matrigel混合的高级DMEM/F12培养基中，按1:1比例接种于24孔板中。传代比例通常为1:2或1:4，代数少于10为早期，10-20代为中期，超过20代为后期。
2.4 类器官低温贮藏
为建立体外活生物库，细胞传代时约2/3细胞被冷冻保存。将细胞与CryoStor® CS10冷冻液混合后，置于-80°C冷冻盒中过夜，次日转移至液氮罐长期保存。
2.5 类器官复苏
类器官复苏基于快速解冻原理，将冷冻管放入37°C水浴中摇晃以加速融化。融化后，将细胞转移到离心管，加入DMEM/F12培养基后离心。去除上清液，保留沉淀，然后将细胞重悬于Matrigel混合培养基中，按1:1比例接种于24孔板，并在37℃培养箱中培养30分钟后加入完全培养基继续培养。
2.6 废弃类器官的处理
类器官培养中污染难以避免。若基质或培养基3天内变混浊，可能是真菌或细菌污染，需丢弃。支原体污染易与类器官混淆，但显微镜下可区分。若怀疑支原体污染，可尝试使用去除剂，无效则需丢弃，并按生物医学废物规定处理。
3.类器官的分子特性及质量控制
类器官可以保留亲本组织的遗传特征和生物学功能，但对其长期传代、冷冻保存、复苏和再培养对其分子特性的影响研究不足。研究表明，短期传代类器官基因突变漂移率低，而长期传代可显著增加基因突变漂移率。基因组学方法如WGS、WES、RNA-seq和scRNA-seq可用于分子分析，核型分析和STR检测用于鉴定类器官系。评估类器官质量的方法包括形态学观察、多种染色技术和ATP含量检测（图2）。
图2
4.实验室标准化建设
构建高质量类器官需要完善的实验室设施。在中国，实验室设施要求因实验目的而异，细胞培养室通常分为三层结构（图3）。
图3
4.1 用于基础研究的细胞培养室
实验室建设需遵循《洁净室设计规范》，环境洁净等级至少满足D+A级。实验室内只放置必要设备，设有物料和样品专用入口，且有特殊出口安排。研究人员通过三层缓冲区进入，包括换鞋、换衣和空气淋浴。基础研究用细胞培养室有严格的洁净等级和细菌标准，温度和湿度需控制，通风量需满足要求，所有操作在净化工作台上进行，工作人员需提前开启空气净化系统和紫外线灯。
4.2 药物开发的细胞培养室
这种细胞培养室专为新药筛选、药敏试验等设计，洁净等级至少达到C+A级。C级标准规定了静态和动态下粉尘颗粒数，浮游细菌和沉积物细菌标准，以及温度、湿度和通风频率。实验操作在A级生物安全柜上进行，工作人员需提前开启空气净化系统和紫外线灯，并通过三层缓冲区进入，设有单独出口以避免交叉污染。
4.3 用于生产治疗级生物药品的细胞培养室
根据《医药行业洁净车间设计标准》，细胞培养室至少需达到B+A级洁净标准，其中B级洁净区在静态和动态条件下对粉尘颗粒数有严格限制，浮游细菌和沉积物细菌标准更为严格。环境温度和湿度也有具体要求。实验操作需在A级生物安全柜中进行，工作人员进入前需提前开启空气净化系统和紫外线灯，并通过三级缓冲区进入实验室，设有单独出口以避免交叉污染。细胞培养室需定期消毒，包括使用多种消毒剂擦拭操作台和可能被污染的空间，消毒后开启空气过滤器和紫外线灯以杀死残留微生物。每次实验后也需消毒工作台表面（表1）。
表1
5.可获得的类器官标准化文件
中国的标准化体系包括国家标准、领域标准、行政区域标准、学术团体标准和企业标准。近年来，中国学术组织积极制定类器官构建标准，如2022年中国医药生物技术协会发布的胃肠道上皮组织类器官构建与保存指南，以及上海市遗传学会和城市行业协会发布的相关技术规范。2023年，CMBA和CSCB发布了多个人组织类器官制备和鉴定标准。CRHA也发布了肝祖细胞衍生类器官的建立和质量控制指南。2024年，青岛市医疗健康产业促进会和中国抗癌协会发布了肝内胆管癌类器官培养和鉴定标准，以及基于人肝类器官的药物性肝毒性评价标准。此外，iPSC在类器官构建中的应用也得到了相关标准的发布支持。指南和专家共识，如《肿瘤精准治疗临床应用专家共识》和《肿瘤类器官诊疗平台质量控制标准中国专家共识》，为类器官平台的药敏试验提供了指导和建议（图4）。
图4
6.类器官标准化进程中的机遇与挑战
类器官研究目前处于早期阶段，缺乏国际和国家标准，学术界虽有相关标准发布，但尚未广泛采纳。类器官的标准化面临挑战与机遇，尤其是在模拟肿瘤微环境（TME）方面。TME中的细胞对肿瘤发展和药物抗性有重要作用，而共培养系统对于研究这些相互作用至关重要。例如，通过胃癌类器官和淋巴细胞共培养，研究团队发现了地塞米松抑制癌细胞免疫逃逸的新机制。此外，类器官与病原微生物如幽门螺杆菌和乙型肝炎病毒的共培养模型为研究肿瘤发生和药物筛选提供了新途径。
类器官构建的标准化之路充满挑战，尤其是在维持类器官均质性和提高成功率方面。实施标准化流程如胃肠上皮组织类器官构建和保存指南，可显著提高构建成功率。AI辅助评估也证实了标准化流程提高了类器官的稳定性和一致性。iPSC/ESC衍生的类器官同样面临标准化问题，涉及多个步骤，尽管本文未详细讨论，但其在研究罕见遗传病和药物靶点筛选中具有潜力。
总体而言，类器官构建的技术操作标准化面临众多挑战，生产成本高，需要加强研发以提高质量和稳定性，促进广泛应用和产业化。未来，结合AI的标准化类器官技术可能促进自动3D培养和质量评估，结合临床大数据或基因组数据的类器官技术可能更好地预测药物敏感性和临床结果。ISO/TC 276委员会已启动类器官相关标准的草案工作，国际合作将推动类器官领域健康和可持续发展。
#3
研究结论
Suggestion
类器官技术的发展为模拟和研究人类疾病提供了强大的工具。这些微型器官模型不仅能够复制真实器官的结构和功能，而且在个性化医疗和药物筛选中展现出巨大潜力。然而，随着类器官应用的增加，确保它们的稳定性和一致性变得尤为重要。这篇综述强调了在类器官构建过程中实施标准化操作的重要性，这对于提高实验的可重复性和可靠性至关重要。未来，我们期待类器官技术能够带来更多突破，为疾病治疗和健康管理开辟新途径。
参考文献
Yang R, Qi Y, Zhang X, Gao H, Yu Y. Living biobank: Standardization of organoid construction and challenges. Chin Med J (Engl). 2024 Dec 12. doi: 10.1097/CM9.0000000000003414. Epub ahead of print. PMID: 39663560.
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来源：培养盒守护者
