摘要：引用格式：杨英杰, 马小清, 李福利, 倪金凤. (2021). 白蚁肠道优势厌氧菌的分离与培养. // 微生物组实验手册.Bio-101: e2003640. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003640.

白蚁肠道优势厌氧菌的分离与培养

Isolation and Culture of Dominant Anaerobes from Termite Intestine

*通讯作者邮箱: jinfgni@sdu.edu.cn;yjyang@sdu.edu.cn

引用格式：杨英杰, 马小清, 李福利, 倪金凤. (2021). 白蚁肠道优势厌氧菌的分离与培养. // 微生物组实验手册. Bio-101: e2003640. DOI: 10.21769/BioProtoc.2003640.

How to cite: Yunyun Gao, Kai Peng, Defeng Bai, et al. 2024. The Microbiome Protocols eBook initiative: Building a bridge to microbiome research. iMeta 3: e182. https://doi.org/10.1002/imt2.182

摘要：宏基因组等高通量测序方法为我们研究人体、动物、植物的生存环境或者体内的微生物组成提供了一个高效便捷的方法，也是理解健康和生病个体内微生物区系变化的一个手段。但是如果分离不到单个微生物，我们就无法通过实验来验证具体的单个微生物在其中的作用，也无法人工构建这样的微生物群落。为解决这样的问题，提出了培养组学的概念。直径只有几百微米的白蚁肠道中心部位是一个严格厌氧环境，厌氧微生物占据优势。为了解其中的厌氧微生物在木质纤维素消化中的功能，在抗生素选择条件下我们成功地分离了其中的优势菌Dysgonomonas新菌种。本文主要介绍白蚁肠道厌氧菌的分离培养方法，为白蚁肠道厌氧菌及其它厌氧环境中细菌的分离培养提供借鉴与参考。

关键词：白蚁肠道，优势菌群，厌氧微生物，抗生素，分离培养

研究背景：宏基因组学和功能基因的高通量测序彻底改变了人类对各类生态环境中微生物的组成和功能的认识和理解，特别是对人类和动物肠道微生物菌群、植物根际微生物菌群在宿主与微生物的共生寄主关系以及健康和疾病之间关系的认识和理解，在此过程中产生了无数未知微生物的序列信息 (Gould等，2018; Schretter等，2018; Marynowska等，2020)。在这样的时代背景下，许多研究者认为已经过时的微生物纯培养技术又得到了重生。相对于对自然环境中的各种各样的微生物群落的基因组进行研究的微生物组概念，为获取这些复杂环境中的单个微生物的过程相应地产生了一个培养组学 (culturomics) 的概念。只有获得群落中的单个微生物之后，才能理解这些微生物的生物学特征和其在群落中的功能，单个微生物的分离培养对于阐明这些微生物在复杂环境中的作用仍然至关重要。比如，它们能够利用什么营养？它们会产生哪些代谢物？它们在环境中如何与其他微生物相互作用？这些未知的微生物可能具有有用的酶、新的抗菌素和其它的新物质。白蚁是以木质纤维素为主食的昆虫，肠道微生物也在纤维素降解过程中发挥重要的作用 (Tokuda等，2018; Marynowska等，2020)。通过微电极检测发现直径只有几百微米的肠道，其内容物的氧化还原电位很低，不同于果蝇等昆虫(Douglas, 2018)，是一个严格厌氧的环境。

从广义上讲，专性厌氧菌 (obligate anaerobes) 可以定义为不能利用氧分子生长的微生物。根据他们与氧气的关系，可进一步分类，如耐氧的厌氧菌 (Aerotolerant anaerobe)、中度厌氧菌 (Moderate anaerobe) 和严格厌氧菌 (Strict anaerobe) 等。耐氧的厌氧菌不能够利用氧气作为末端电子受体，但是对氧气不敏感，部分菌种可在一定时间内耐受空气中的氧气 (耐受时间长短因物种而已)。中度厌氧菌暴露在室温空气中60~90 min后再回接到厌氧状态下，其生存率不会损失太多，比如脆弱拟杆菌等 (Loesche, 1969)。严格厌氧菌对氧气非常敏感，环境中的溶解氧高于5 µM时就会影响它们的生长 (Engelkirk等，1992)。短时间内暴露在低浓度的氧气中就会死亡或者停止生长，它们一般含有一套不同于好氧微生物的氧化还原系统。因此，在处理这些微生物的所有步骤中保持缺氧状态非常重要。为了维持严格厌氧菌的生长，要保证培养基的氧化还原电位低于-330 mV，这可以通过添加还原剂实现。大多数厌氧微生物是很苛刻的，需要复杂的添加物才能生长。结合16S高通量测序也发现白蚁肠道内厌氧微生物占据优势。我们团队前期从白蚁肠道中分离了一些厌氧细菌 (Yang等，2014)，结合当前兴起的人类肠道培养组学的发展，就白蚁肠道厌氧菌的分离培养方法和注意事项介绍如下。

材料与试剂

1.一次性医用无菌注射器 (1 ml、5 ml、10 ml)

2.刃天青 (生工生物工程有限公司, catalog number: A606726 )

3.L-胱氨酸 (生工生物工程有限公司, catalog number: A610088)

4.半胱氨酸盐酸盐 (生工生物工程有限公司, catalog number: A506578)

5.维生素K1 (生工生物工程有限公司, catalog number: A606528)

6.氯化血红素 (生工生物工程有限公司, catalog number: A602521)

7.诺氟沙星 (生工生物工程有限公司, catalog number: A506250)

8.L-色氨酸 (生工生物工程有限公司, catalog number: A601911)

9.L-精氨酸 (生工生物工程有限公司, catalog number: A600205)

10.琼脂 (生工生物工程有限公司, catalog number: A505255)

11.胰酶解蛋白胨 (Oxoid, England, catalog number: LP0042)

12.酵母粉 (Oxoid, England, catalog number: LP0021)

13.蛋白胨 (北京奥博星生物技术有限责任公司，catalog number: 01-001)

14.大豆蛋白胨 (青岛海博生物技术有限公司，catalog number: HB8275)

15.牛肉浸粉 (青岛海博生物技术有限公司，catalog number: HB8272)

16.肝浸粉 (青岛海博生物技术有限公司，catalog number: HB8289)

18.维生素 (生物素、叶酸、吡哆醇盐酸、硫胺素盐酸、核黄素、烟酸、泛酸钙、维生素B12、对氨基苯甲酸、硫辛酸) (皆购自国药集团化学试剂有限公司，中国，生化试剂)

19.16S rRNA通用引物: 16S-27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)，16S-1492R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’) 合成于北京擎科生物科技有限公司

20.预还原缓冲液 (0.1 M PBS缓冲液) (见溶液配方)

21.GAM培养基 (见溶液配方)

22.MM14培养基 (见溶液配方)

23.100倍微生素溶液 (见溶液配方)

仪器设备

1.厌氧工作站 (COY Laboratory Products, INC, United States, model: AC09-086)

2.厌氧袋 (MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC，model: C-43)

3.厌氧罐 (OXOID LTD WADE ROAD, ENGLAND品牌THERMO OXOID，model: AG0025A)

4.厌氧管、丁基胶塞、铝盖、铝盖封口钳子、螺旋口厌氧培养瓶 (50 ml、100 ml、250 ml) 等

5.超净工作台

6.高压灭菌锅

7.恒温培养箱

8.200 °C烘箱

9.磁力搅拌器及其转子

10.分析天平

11.有机玻璃面罩

12.气瓶 (德海伟业科技公司，青岛)

13.PCR仪 (伯乐，北京)

软件和数据库

1.利用细菌16S序列进行菌种鉴定网站

2.Lasergene等DNA序列分析软件

3.各国菌种保藏中心网址 (可参考各种培养基的配制方法，并且每种微生物都有其对应的培养基)

1)德国微生物菌种保藏中心 (DSMZ) Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures

2)日本菌种保藏中心 (JCM) Japan Collection of Microorganisms

3)韩国菌种保藏中心 (KCTC) Korean collection for type cultures

4)BacDive 的数据库，其中罗列了来自34个细菌门和3个古细菌门的超过80,000株培养菌株的特性和培养条件，包括约90%的模式菌株

5)中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）China General Microbiological Culture Collection Center（http://www.cgmcc.net/）

6)美国典型菌种保藏中心（ATCC）American Type Culture Collection ，可通过国内北纳生物等代理公司购买。

实验步骤

一、厌氧培养基和预还原溶液的配制

1.预还原缓冲液的配制：按照常规方法室温配制好0.1 M磷酸缓冲液后，煮沸驱氧10 min，冷却后加入刃天青指示剂 (1 mg/L)，在厌氧工作站内搅拌可由蓝色变至粉红色，表明溶液内含氧量已经比较少了，之后经过高温蒸汽灭菌，厌氧瓶内气体膨胀致使残留的氧气排出，最终溶液变为无色。在使用前如果变为粉红色，可滴加保险粉溶液 (1 g/L) 至无色。

2.用60 μl冰醋酸溶解5 mg维生素K1，现用现配。维生素K1是黄色透明粘稠的液体，在水中不溶。大多数厌氧微生物是非常脆弱的，需要许多成分复杂的添加物作为生长的培养基，像维生素B12也经常添加。在不确定的情况下，都要添加微生素复合物。参照溶液配方中的100倍微生素溶液，厌氧过滤除菌存于4 °C冰箱的厌氧瓶内，在培养基使用前加入维生素。

3.血红素溶解在0.1 M碳酸钠水溶液中制成2 mg/ml的200倍储存液50 ml，过滤后存于4 °C冰箱，在培养基使用前加入。培养肠道等动物来源的厌氧微生物经常见到其他培养基成分灭菌后添加5%的无菌动物血，因为厌氧微生物营养需求复杂，需在培养基使用前加入。

4.厌氧培养基中的还原剂成分跟氮源、无机盐等其他成分混合溶解后在厌氧工作站内磁力搅拌除氧，同时将主要碳源和氮源粉末称量后放在干净的烧杯一起放入厌氧工作站内。除氧过程需要持续几个小时甚至过夜使氧化还原指示剂刃天青由粉红色变为无色。两者分开的目的是避免在厌氧工作站内长时间除氧过程中杂菌的繁殖生长。粉末和水先分开，除氧后再混到一起。分装至Hungate厌氧管或者厌氧瓶，分装量不超过总容积的三分之一，以防灭菌时破裂。

5.保险粉溶液的配制：首先，用煮沸10 min的水溶解保险粉制成1 g/L溶液。其次，在超净工作台内利用一次性无菌滤器过滤于无菌试管内，再利用一次性无菌注射器针头分装于充满无氧气体 (如氮气、氮气/二氧化碳混合气等) 的无菌厌氧瓶。注意在注射时先利用溶液将针头和注射器顶部内空气排出。另外，为避免针头和塞子表面染菌在超净台内转移两个厌氧管内液体时也要注意两个厌氧瓶内的气体压力差，注射液体后回吸同样体积的气体到取样瓶中。可以用保险粉来降低氧化还原电位。新制备的保险粉储备溶液在黑暗、室温下只能储存2~3周，最好现配现用。如果培养基在使用前发现变色，可以添加保险粉溶液至无色。对培养厌氧要求非常苛刻的菌也可以添加保险粉溶液。

二、固体厌氧平板和固体厌氧管的准备

1.装有固体培养基的厌氧瓶高压蒸汽灭菌后，将一次性无菌培养皿和冷却到60 °C左右的无菌厌氧培养基放入消毒过的厌氧工作站内。倒入平板的培养基厚度达到平板厚度的二分之一，立即盖上平板盖子，冷却后倒置于厌氧工作站内，放置两三天。目的是除去冷凝水、验证没有杂菌污染，同时保证刃天青不变红。

2.装有固体培养基的厌氧管高压蒸汽灭菌后，不必再放入厌氧工作站内。冷却至60 °C后，置于加入自来水 (室温) 的容器中，缓慢旋转，待固体培养基在厌氧管内壁凝固形成一薄层。一般用厌氧管体积的1/5~1/4比较合适。

三、

来源：微生物组