摘要：特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种常见的炎症性皮肤疾病，特征为剧烈瘙痒、复发性湿疹样病变和Th2介导的免疫反应。调节性T细胞（Regulatory T cell，Treg）在调控炎症、抑制Th2细胞(T helper 2 cell)和
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特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种常见的炎症性皮肤疾病，特征为剧烈瘙痒、复发性湿疹样病变和Th2介导的免疫反应。调节性T细胞（Regulatory T cell，Treg）在调控炎症、抑制Th2细胞(T helper 2 cell)和维持免疫稳态中发挥关键作用。先前的研究对于AD患者中Treg比例存在冲突结果，一些研究发现Treg比例未改变，而其他研究则报告Treg数量增加。在过敏性疾病中，Treg对Th2细胞的抑制作用被破坏以及Th2型炎症的促进背后的精确分子机制尚不清楚。因此，探究AD中Treg数量和功能变化背后的分子机制至关重要。
近日，南方医科大学皮肤病医院梁云生课题组探讨了在特应性皮炎（AD）中，Treg数量和功能变化的分子机制，以及这些变化如何影响Th2型炎症。相关研究成果以“IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis”为题发表在《Journal of Dermatological Science》期刊。深圳易基因科技为本研究提供靶基因甲基化测序（Target-BS）技术服务。
研究通过流式细胞术、mRNA测序（mRNA-seq）、共培养实验、共免疫沉淀、染色质免疫沉淀和亚硫酸盐测序（BS-seq）等方法，在体外或AD小鼠模型以及AD患者中研究分子机制。分析结果表明在轻度和中度AD中检测到Treg比例增加。而在重度AD患者中，Treg数量和CTLA-4表达特征性减少则与血清IL-4 (interleukin-4)水平相关，这与体外高浓度IL-4处理下的验证分析结果一致。其背后机制是IL-4/pSTAT6通路招募DNMT1和HDAC2来抑制Foxp3和CTLA-4位点的转录调控。高水平的IL-4破坏了Treg通过CTLA-4介导的Th2细胞分化抑制，而在Treg中阻断IL-4Rα信号恢复了AD模型小鼠和AD患者的Treg数量和Th2细胞抑制。
总之，本研究结果表明，Treg数量及AD患者严重程度分级与血清IL-4水平相关。异常高水平IL-4表观遗传调控Treg数量和CTLA-4表达减少。IL-4诱导Treg上的CTLA-4表达减少损害了Th2细胞分化抑制。
研究方法
研究队列：42名AD患者和14名健康志愿者（(healthy volunteers，HVs），以及用于实验的特定基因敲除小鼠。通过MC903诱导AD小鼠模型，评估耳厚度和组织学变化。从人和小鼠样本中分离和分化细胞，进行Treg抑制实验和流式细胞术分析。使用ELISA和Western blotting技术分析血清和蛋白表达水平。通过亚硫酸盐测序（Target-BS）和共免疫沉淀实验分析DNA甲基化和蛋白相互作用。进行染色质免疫沉淀（ChIP）和RT-qPCR分析特定基因位点的表观遗传修饰。结果图形
（1）Treg数量与AD严重程度分级和血清中IL-4水平相关。IL-4导致重度AD患者的Treg数量和CTLA-4表达减少。
图1. IL-4水平增加导致重度AD患者中Treg数量和CTLA-4表达减少。
A. AD患者和健康志愿者（HVs）中Foxp3+ CD25+ Treg（在CD3+ CD4+ T细胞中筛选）的代表性流式细胞术和定量分析。
B. AD患者和HVs的血清IL-4水平。
C. 重度AD患者和年龄性别匹配的健康志愿者外周血中CTLA-4+表达（在CD3+ CD4+ Foxp3+ CD25+ Treg中筛选）的代表性流式细胞术和定量分析。
D. AD患者中Foxp3+、CTLA-4+表达与血清IL-4水平之间的相关性。
E. 培养的Treg中Foxp3+ CD25+ Treg（在CD4+ T细胞中筛选）、CTLA-4+表达（在CD4+ T细胞中筛选）的代表性流式细胞术和定量分析。
（2）IL-4/pSTAT6信号通路如何通过招募DNA甲基转移酶1（DNMT1）和组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）来抑制Foxp3和CTLA-4基因位点的转录调控。
图2. IL-4/pSTAT6通路招募DNMT1和HDAC2来抑制Foxp3和CTLA-4位点的转录调控。从健康志愿者（HV）的外周血单个核细胞（PBMCs）中纯化出初始T细胞，并在体外用IL-2/TGFβ1培养4天，然后有或没有高浓度IL-4刺激额外3天。
A. 聚类热图显示培养的Treg中转录因子差异表达，其中深红色表示高基因表达水平。
B. Western blotting分析TETs、DNMTs和HDACs蛋白。
C. Target-BS分析Foxp3和CTLA-4位点的CpG DNA甲基化，以分析IL-4处理/未处理组Treg的甲基化状态。图表显示通过亚硫酸盐测序鉴定的DNA甲基化数量。
D. 收集Treg细胞、裂解，并用抗pSTAT6抗体免疫沉淀（IP）。通过免疫印迹法分析IP蛋白，使用抗DNMTs或抗pSTAT6抗体。
E. 使用抗DNMT1和抗pSTAT6抗体进行ChIP实验。通过实时PCR检测Foxp3启动子和CNS2的免疫沉淀DNA的相对量，并相对于IgG进行归一化。
F. Treg被转染HDAC2 siRNA或对照siRNA，并在体外用IL-2/TGFβ1培养4天，然后有或没有高浓度IL-4刺激额外3天。代表性的流式细胞术和定量分析Foxp3+和CTLA-4+表达。
G. 使用抗HDAC2和抗pSTAT6抗体进行ChIP实验。通过实时PCR检测Foxp3和CTLA-4启动子的免疫沉淀DNA的相对量，并相对于IgG进行归一化。每组n=3，三个重复。
（3）高水平IL-4破坏了CTLA-4介导的Treg对Th2细胞分化的抑制作用。
图3. 高水平IL-4破坏了CTLA-4介导的Treg对Th2细胞分化的抑制作用，OTII小鼠脾脏中分离的CTV标记的CD4+ CD25− Teffs和从BMDCs衍生的DCs与Foxp3YFP/Cre或Il4rafl/fl Tregs以1:1:1的比例共培养2天。
A. CTV标记的Teffs数量和定量。
B. Teffs中IL-4表达的代表性流式细胞术和定量分析。每组n=3，三个重复。
（4）IL-4在AD小鼠模型中破坏了Treg对Th2型炎症的抑制作用。
图4. IL-4破坏了AD小鼠模型中Treg对Th2型炎症的抑制作用。
A. 第16天用乙醇（EtOH）或MC903处理的小鼠耳朵的代表性图像和组织学H&E染色结果。
B-C. 第16天从整个耳朵和血液中IL-4+表达的代表性流式细胞术和定量分析。
D-E. 第16天从整个耳朵和血液中Foxp3+ CD25+ Treg和CTLA-4+表达的代表性流式细胞术和定量分析。每组n=3只小鼠，三个重复。
（5）达必妥(Dupilumab) 恢复了重度AD患者的Treg数量和CTLA-4表达，并抑制Th2型炎症。
图5. Dupilumab恢复了重度AD患者的Treg数量和CTLA-4表达及其对Th2炎症的抑制作用。
A. 在不同时间点对AD患者外周血中Foxp3+ CD25+ Treg的代表性流式细胞术和定量分析。
B. CTLA-4+ Foxp3+ Treg的代表性流式细胞术和定量分析。
C. 在不同时间点对Th2细胞的代表性流式细胞术和定量分析。
易小结
Treg数量和AD的严重程度分级与血清IL-4水平相关。异常高水平的IL-4表观遗传调控Treg数量和CTLA-4表达减少。Treg中由IL-4诱导的CTLA-4表达减少破坏了Th2细胞分化抑制。阻断Treg中的IL-4Rα信号可以恢复Treg数量和对Th2型炎症的抑制，为AD治疗提供了新的策略和深入的机制理论。易基因：DNA甲基化研究基本思路
DNA甲基化一般遵循四个步骤：
首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析，包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。
其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。
再次，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。
最后，对筛选出的目标区域DNA甲基化进行验证，通常采用靶基因重亚硫酸盐测序（Target-BS）。
关于易基因靶基因DNA甲基化测序（Target-BS）
对目标基因/CpG 位点甲基化检测，建立灵活的靶向甲基化测序技术。易基因建立的靶基因甲基化高通量测序（Target Bisulfite sequencing，Target-BS）是针对已有目标基因panel组合，运用易基因自主研发的甲基化特异性多重PCR引物设计软件，对亚硫酸盐转化后的目标基因多重扩增，建库后进行超高深度（1000X以上）甲基化精准检测。
应用方向：
Target-BS广泛用于已知位点的甲基化Biomarker筛选、验证及临床转化应用
后续目标基因的甲基化验证技术优势：
多基因多重扩增，检测通量高；超高深度亚硫酸盐甲基化测序，相对于传统BSP克隆测序，检测灵敏度、准确性高，可准确检测到样本中低于1%的甲基化水平；样本需求量低，20ng基因组DNA可实现多基因扩增；适用范围广，对基因组DNA、FFPE样本、游离cfDNA等样本均适用；检测费用显著低于现有技术、快周期、超高性价比。易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C）、染色质结构与功能组学技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900。
参考文献：
Wang B, Yu Z, Liu J, Tian Y, Ruan Y, Kong T, Hou M, Yu B, Ling S, Wang D, Chen Y, Xu Y, Deng W, Liang Y. IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis. J Dermatol Sci. 2024 Mar 23. pii: S0923-1811(24)00053-7. doi: 10.1016/j.jdermsci.2024.03.007. PubMed PMID: 38556434.
来源：易基因科技
