摘要：组织稳态的精准调控依赖基因表达网络的动态平衡，而基因编辑技术的革新为解析稳态机制与疾病因果关系提供了革命性工具。本文系统阐述 CRISPR/Cas9 等基因编辑技术的发展历程，及其在揭示 TGF-β、Wnt/β-catenin 等信号通路调控组织稳态中的应用，
组织稳态的精准调控依赖基因表达网络的动态平衡，而基因编辑技术的革新为解析稳态机制与疾病因果关系提供了革命性工具。本文系统阐述 CRISPR/Cas9 等基因编辑技术的发展历程，及其在揭示 TGF-β、Wnt/β-catenin 等信号通路调控组织稳态中的应用，探讨基因编辑模型如何阐明疾病发生的遗传基础，并展望其在精准医学中的转化前景。
CRISPR/Cas9 系统：凭借向导 RNA（sgRNA）的可编程性，实现对基因组 DNA 的定点切割，引发非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）。其衍生技术如 **Base Editing（碱基编辑）** 可实现单碱基替换（如 C→T 或 A→G），避免双链 DNA 断裂带来的脱靶风险 [[1]]；**Prime Editing（Prime 编辑）** 则通过逆转录酶将 pegRNA 携带的编辑信息写入基因组，支持插入、缺失及任意碱基替换 [[2]]。单碱基编辑技术的特异性提升：
胞嘧啶碱基编辑器（CBE）与腺嘌呤碱基编辑器（ABE）的脱氨酶结构域优化（如 xCas9、SpRY 变体），使其能识别更宽泛的 PAM 序列（如 NG、NGA），适用于基因组复杂区域的编辑 [[3]]。病毒载体系统：
腺相关病毒（AAV）因其低免疫原性和组织 tropism 成为体内编辑首选。例如，AAV8 靶向肝细胞，AAV9 穿透血脑屏障，已成功用于肝脏代谢疾病与神经退行性疾病模型的基因校正 [[4]]。非病毒递送技术：
脂质纳米颗粒（LNP）包裹的 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白（RNP）在体内可实现肺上皮细胞（如雾化吸入）和肿瘤组织的高效转染，避免基因组整合风险 [[5]]。肠道干细胞（ISC）的 CRISPR 筛选：
通过全基因组敲除筛选，发现 APC 基因缺失导致 β-catenin 异常积累，激活 Wnt 通路并维持 ISC 无限增殖，而 Notch1 敲除则促使 ISC 向分泌型细胞（如杯状细胞）分化 [[6]]。造血干细胞（HSC）的表观遗传编辑：
使用 CRISPR-dCas9 激活 HSC 静息态相关基因（如 HoxB4、Meis1），可延长其体外培养周期而不丧失多向分化潜能，为造血干细胞移植提供新策略 [[7]]。TGF-β 与 Wnt 通路的拮抗机制：
在结肠类器官模型中，利用 Base Editing 构建 SMAD3（TGF-β 通路）与 APC（Wnt 通路）双突变细胞，发现 SMAD3 的 R213H 突变（增强与 β-catenin 结合）可部分逆转 APC 缺失导致的增殖失控，揭示两条通路在转录水平的直接竞争 [[8]]。Notch-Hedgehog 时空互作的体内验证：
通过条件性敲除小鼠软骨细胞中的 Gli2（Hedgehog 通路），发现 Notch 配体 Jagged1 表达显著下调，导致软骨内成骨延迟，证实 Hedgehog 对 Notch 的上游调控作用 [[9]]。CRISPR 介导的 MMPs 家族功能解析：
在肺纤维化模型中，逐一敲除 MMP-2、MMP-9、MMP-13，发现 MMP-13 缺失可显著减少胶原蛋白降解，加重纤维化，而 MMP-9 缺失则通过抑制炎症细胞浸润减轻损伤，揭示 ECM 降解酶的功能异质性 [[10]]。纤连蛋白（FN1）剪切异构体的编辑研究：
使用 Prime Editing 纠正 FN1 pre-mRNA 剪切位点突变，恢复 FN-EDA + 异构体表达，可增强成纤维细胞迁移能力，促进皮肤伤口愈合 [[11]]。癌基因成瘾性的体内验证：
在 KRASG12D 驱动的胰腺癌模型中，通过 CRISPR-Cas9 敲除 KRAS 或其下游效应分子 RAF1，发现肿瘤生长迅速停滞，而敲除非成瘾性基因（如 MYC）仅导致部分生长抑制，证实 KRAS 通路的不可替代性 [[12]]。肿瘤微环境的编辑重塑：
敲除肿瘤相关成纤维细胞（CAF）中的 TGF-β1，可减少 M2 型巨噬细胞极化并增强 CD8+ T 细胞浸润，与 PD-1 抗体联合使用可显著抑制小鼠黑色素瘤进展 [[13]]。单基因病的编辑建模：
在 β- 地中海贫血患者来源的 iPSC 中，利用 CBE 纠正 HBB 基因的 c.20A>T 突变（导致密码子 7 变为终止子），诱导分化的红细胞可恢复正常血红蛋白合成 [[14]]。多基因病的协同突变效应：
在家族性腺瘤性息肉病（FAP）小鼠模型中，同时编辑 APC（Wnt 通路）与 TP53（抑癌通路），发现双突变显著加速息肉恶变进程，且伴随 Notch 通路异常激活，揭示肿瘤发生的多步骤遗传损伤模型 [[15]]。端粒酶基因（TERT）的编辑研究：
在早衰症（Hutchinson-Gilford 综合征）成纤维细胞中，通过 CRISPR 激活内源性 TERT 表达，可延长端粒长度并逆转衰老表型（如 β- 半乳糖苷酶活性降低、核纤层蛋白 A 异常减少）[[16]]。衰老相关分泌表型（SASP）的基因编辑抑制：
敲除衰老细胞中的 NF-κB 亚基 RelA，可显著减少 IL-6、MCP-1 等促炎因子分泌，缓解相邻正常细胞的旁分泌衰老诱导 [[17]]。体内直接编辑疗法：
CRISPR Therapeutics 公司的 CTX001 通过编辑造血干细胞的 BCL11A 增强子，激活胎儿血红蛋白（HbF）表达，用于治疗镰状细胞贫血和 β- 地中海贫血，已进入 Ⅲ 期临床试验 [[18]]。类器官模型指导的个性化治疗：
利用患者来源的肿瘤类器官进行 CRISPR 筛选，可快速鉴定个体化药敏基因（如 PTEN 缺失型肿瘤对 PI3K 抑制剂敏感），为精准用药提供依据 [[19]]。脱靶效应的监测与规避：
高灵敏度检测技术如 Digenome-seq、GUIDE-seq 可在全基因组水平扫描脱靶位点；优化 Cas9 变体（如 HypaCas9、xCas9）结合高保真 sgRNA 设计，将脱靶率降低至接近背景水平 [[20]]。递送效率与组织特异性的平衡：
双特异性抗体靶向递送（如抗 EpCAM 抗体偶联 LNP-Cas9）可增强实体瘤编辑效率，而 RNA 适配体（Aptamer）修饰的纳米颗粒可实现特定细胞类型（如神经元、内皮细胞）的精准转染 [[21]]。生殖细胞编辑的伦理争议：
国际干细胞研究学会（ISSCR）2021 年指南明确禁止可遗传的生殖细胞编辑，强调基础研究需在严格监管下进行 [[22]]。免疫原性风险的控制：
重复给药时 Cas9 蛋白可能引发适应性免疫反应，开发 Cas9 同源蛋白（如来自金黄色葡萄球菌的 SaCas9、化脓链球菌的 SpCas9 变体）或非免疫原性的碱基编辑系统（如 Prime 编辑）可降低免疫风险 [[23]]。动态编辑技术：利用光控 CRISPR（如 Cas9 - 隐花色素系统）或化学诱导系统（如 ERT2-Cas9），实现基因编辑的时空可控，解析稳态调控的动态过程 [[24]]。多组学整合研究：结合单细胞测序与 CRISPR 扰动，构建组织稳态的基因调控网络图谱（如 “CRISPR-ATAC-seq” 解析染色质可及性变化）[[25]]。体内稳态修复策略：通过编辑组织驻留干细胞或基质细胞，重建受损组织的稳态调控回路，例如编辑间充质干细胞的 TGF-β 通路以逆转肺纤维化 [[26]]。
总之，基因编辑技术不仅是解析组织稳态与疾病机制的强大工具，更有望通过直接干预致病基因网络，实现从 “疾病治疗” 到 “稳态修复” 的医学模式变革。未来需跨学科协同创新，解决技术瓶颈并严守伦理边界，推动基因编辑在精准医学中的安全有效应用。
来源：医学顾事