摘要：局部炎症调节和干细胞治疗在椎间盘变性（IDD）的治疗中引起了广泛关注。然而，严重的氧化应激和有限的髓核（NP）样干细胞分化在很大程度上损害了生物材料植入的治疗效果。由于出色的注射性和流动性，以及对NP组织的轻微压缩，水凝胶微球已成为IDD治疗的有吸引力的载体。

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局部炎症调节和干细胞治疗在椎间盘变性（IDD）的治疗中引起了广泛关注。然而，严重的氧化应激和有限的髓核（NP）样干细胞分化在很大程度上损害了生物材料植入的治疗效果。由于出色的注射性和流动性，以及对NP组织的轻微压缩，水凝胶微球已成为IDD治疗的有吸引力的载体。

近期，来自华中科技大学的朱锦涛/江浩团队＆华中科技大学同济医学院附属协和医院的张宇坤团队开发了一种由Wnt5a模拟肽Foxy5-和抗氧化肽接枝明胶甲基丙烯酰基质（GFA）组成的可注射水凝胶微球，作为IDD治疗的干细胞递送系统（方案1）。

相关研究成果以“Injectable hydrogel microspheres promoting inflammation modulation and nucleus pulposus-like differentiation for intervertebral disc regeneration”为题于2025年2月15日发表在《Journal of Controlled Release》上。

方案1 用于IDD综合治疗的GFA水凝胶微球的示意图

1. GFA水凝胶微球的制备和表征

首先，研究者通过微流控技术制备了基于GelMA的微流体水凝胶微球（GFA）。明场显微镜图像显示，GFA水凝胶微球具有良好的分散性和均匀的尺寸（图1a）。SEM图像揭示了GFA水凝胶微球的多孔结构（图1b），XPS光谱中硫峰的存在证实了Foxy5（分子结构中含有蛋氨酸和半胱氨酸残留物）成功移植到GFA水凝胶微球上（图1c）。此外，GFA水凝胶具有足够的机械强度，可以避免注射后爆裂破坏并提供机械线索指导MSC分化（图1d）。降解实验表GFA水凝胶微球可以防止BMSCs爆发丢失，并为它们的长期细胞增殖和分化提供有利条件（图1e）。

图1 GFA 水凝胶微球的制备和表征

2. GFA水凝胶微球的生物相容性

作为IDD治疗的可注射支架，GFA水凝胶微球需要出色的细胞包埋、递送和增殖生物相容性。CCK8结果表明，GM和GFA的细胞毒性可以忽略不计（图2a-b），且GFA具有良好的体外生物安全性（图2c）。细胞增殖实验进一步证实了GFA水凝胶微球具有支持细胞增殖和迁移的能力（图2d-f）。

图2 GFA水凝胶微球支持BMSC的存活和增殖

3. 体外抗氧化和抗炎作用

随后，研究者发现GFA微球可能通过促进NRF-2的核转位发挥内源性抗氧化作用，进而增强抗氧化剂HO-1的表达（图3a，c）。定量分析了GFA对TBHP诱导的炎症的缓解作用，western blot分析显示，炎性细胞因子的分泌随着GFA处理而降低（图3b，d）。此外，qRT-PCR分析显示mRNA表达与蛋白质水平一致，表明GFA可以下调炎症相关基因的表达（图3g∼i）。

图3 GFA水凝胶微球激活内源性抗氧化并降低BMSCs的炎症水平

4. GFA水凝胶微球诱导的BMSCs NP样分化

作者在此主要探讨了GFA水凝胶微球对骨髓来源间充质干细胞（BMSCs）分化为类似髓核（NP-like）表型的诱导作用。首先，通过免疫荧光染色检测了NP样分化标志物SOX9和KRT19的蛋白表达（4a~b）。结果显示，与对照组和GM组相比，GFA组中BMSCs的SOX9和KRT19表达显著增强，表明GFA微球能够有效诱导BMSCs向NP样表型分化。通过流式细胞术进一步量化了SOX9和KRT19的表达水平（图4c~d）。结果显示，GFA处理后，超过90%的BMSCs表现出更高的SOX9和KRT19表达水平，进一步证实了GFA微球的诱导效果。此外，作者还通过免疫荧光染色检测了BMSCs在GFA处理后产生的NP样ECM成分，包括aggrecan（ACAN）和II型胶原（COL2）（图4e~f）。结果表明，GFA处理显著提高了ACAN和COL2的表达，这与NP细胞的特征相符，进一步证明了GFA微球在促进NP样分化和ECM再生方面的潜力。综上所述，GFA水凝胶微球能够有效诱导BMSCs分化为NP样表型，并促进NP样ECM成分的生成，为椎间盘再生提供了细胞基础。

图4 GFA水凝胶微球促进了BMSC的NP样分化

5. GFA水凝胶微球的治疗作用机理

基于上述结果，作者进一步探讨了GFA水凝胶微球发挥治疗效果的潜在机制。为了深入理解其作用机制，作者首先进行了RNA测序（RNA-seq）分析：通过RNA-seq技术比较了GFA处理组和对照组BMSCs的基因表达差异（图5a和5b）。结果显示，GFA处理显著影响了3200个基因的表达，其中1315个基因下调，1885个基因上调。通过GO分析，研究者发现GFA处理显著激活了细胞外基质（ECM）组织和胶原纤维组织相关基因的表达（图5c），表明GFA能够促进BMSCs合成ECM成分以修复髓核基质。KEGG分析进一步揭示了GFA通过调节TNF和IL-17B信号通路降低炎症水平（图5d和5e）。

作者通过Western blot验证了GFA处理后BMSCs中CaMKK2、PRKACB（PKA的标志物）和SOX9的蛋白表达上调（图5g）。此外，使用CaMKK2特异性抑制剂CC-3240可以显著抑制PRKACB和SOX9的表达，从而证实了GFA通过激活CaMKK2/PKA/SOX9信号通路诱导BMSCs分化为NP样表型（图5h）。

综上所述，GFA水凝胶微球通过激活CaMKK2/PKA/SOX9信号通路促进BMSCs向NP样表型分化，并通过抑制IL-17B/NF-κB信号通路降低炎症水平，从而实现椎间盘再生的治疗效果。这些发现为GFA微球在椎间盘退行性病变治疗中的应用提供了理论依据。

图5 分析潜在信号通路调节GFA水凝胶微球对BMSC的综合作用

6. GFA水凝胶微球诱导的BMSCs NP样分化

通过建立大鼠尾椎穿刺诱导的椎间盘退行性病变（IDD）模型，评估了GFA水凝胶微球在体内促进椎间盘（IVD）再生的效果（图6a~b）。为了验证GFA微球的治疗效果， 作者在术后4周和8周，对各组大鼠进行磁共振成像（MRI）检查，测量椎间盘高度指数（DHI）并进行Pfirrmann分级（图6c~f）。结果显示，穿刺组和GM组的DHI显著下降，椎间盘信号减弱，表明椎间盘结构受损。相比之下，GFA+BMSC组的DHI下降不显著，且在8周时T2加权成像接近正常对照组，Pfirrmann分级也显著低于穿刺组和GM组，表明GFA微球能够有效维持椎间盘高度并减少病理变化。

图6 BMSC负载的GFA水凝胶微球的体内效应的放射学评估

通过苏木精-伊红（H&E）、Masson三色染色和Safranin O-fast green（SO-FG）染色评估不同组椎间盘的组织学变化（图7）。结果显示，穿刺组和GM组的椎间盘结构受损严重，髓核细胞数量减少，纤维环与髓核的界限模糊。而GFA+BMSC组的椎间盘结构得到显著改善，髓核区域富含蛋白多糖（SO-FG染色呈红色），且细胞排列规整，表明GFA微球能够促进椎间盘组织的再生。

图7 对不同组的IVD的组织学和免疫组织化学评估

作者还检测了椎间盘组织中炎症因子IL-1β和基质成分COL2的表达（图7c~d）。结果显示，GFA+BMSC组的IL-1β表达显著降低，表明炎症水平得到有效抑制；而COL2表达显著增加，表明GFA微球能够促进椎间盘基质的重建。

综上， GFA水凝胶微球作为一种多功能的干细胞递送系统，通过其抗氧化、抗炎以及促进髓核样细胞分化和细胞外基质（ECM）再生的特性，成功改善了椎间盘退行性病变（IDD）的病理进程。在体外实验中，GFA微球显著降低了细胞内氧化应激水平，并通过抑制IL-17B/NF-κB信号通路减轻炎症反应。此外，GFA微球通过激活CaMKK2/PKA/SOX9信号通路，有效诱导骨髓来源间充质干细胞（BMSCs）分化为髓核样细胞，促进了NP基质的生成。在体内实验中，GFA微球显著减轻了局部炎症，维持了椎间盘高度，并促进了椎间盘组织的再生。这些结果表明，GFA水凝胶微球是一种有前景的IDD治疗策略，能够通过调节微环境和促进细胞再生来逆转椎间盘退行性病变的进展。

来源：EngineeringForLife一点号