摘要：癌症作为全球最严重的健康威胁之一，其发生与发展过程中的DNA异常甲基化变化一直备受关注，近年来已成为癌症早期筛查、动态监测和预后评估的重要标志物。近期，重庆大学附属肿瘤医院肿瘤学实验室向廷秀教授团队与新南威尔士大学生物医学工程学院邓飞教授团队展开紧密合作，并于
转自：生物谷
癌症作为全球最严重的健康威胁之一，其发生与发展过程中的DNA异常甲基化变化一直备受关注，近年来已成为癌症早期筛查、动态监测和预后评估的重要标志物。近期，重庆大学附属肿瘤医院肿瘤学实验室向廷秀教授团队与新南威尔士大学生物医学工程学院邓飞教授团队展开紧密合作，并于2025年12月17日，在国际核酸研究领域顶级期刊《Nucleic Acids Research》上发表了题为“Amplification-free cancer diagnosis based on inhibition of Cas12a activity by site-specific 5mC-modified cfDNA”（免扩增癌症筛查方法CRISPR-MeDNA Test：基于位点特异性5mC修饰cfDNA对Cas12a活性抑制）的最新研究成果。该研究首次系统性地揭示了DNA甲基化修饰对CRISPR-Cas12a反式切割活性的抑制作用及其背后的构象调控机制，并基于这一发现，开发出了一种无扩增、快速液体活检技术——CRISPR-MeDNA Test，为肿瘤早期筛查开辟了新的研究视角和应用前景。
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发现现象：5mC修饰DNA——Cas12a活性受制于“锁链”
研究团队通过设计不同甲基化模式的DNA序列，揭示了5mC修饰对CRISPR-Cas12a反式切割活性的“锁链”效应。实验结果显示，无论是双链DNA（dsDNA）还是单链DNA（ssDNA），5mC修饰都显著降低了Cas12a的切割效率，且这种抑制作用与甲基化位点的位置和数量呈现出复杂的非线性关系（图1）。这一发现为我们理解CRISPR系统在甲基化DNA中的作用提供了全新的视角。
图1. 5mC 修饰与未修饰双链 DNA 对 Cas12a 反式切割活性的差异影响
深入解析：5mC修饰——“边缘效应”引发的活性失衡
为进一步探索5mC对Cas12a反式切割活性的影响，研究团队深入研究了单个位点和间隔性5mC修饰的变化对Cas12a活性的作用。结果表明，当5mC修饰位点逐渐远离PAM序列时，Cas12a的切割活性逐渐减弱，呈现出明显的“边缘效应”（图2）。尤其在双链DNA中，当5mC修饰位点间隔为7个核苷酸时，FnCas12a和LbCas12a的活性抑制效应达到最强。
图2. 单一位点与间隔分布的 5mC 修饰对 Cas12a 活性的敏感性差异
全新洞察：半甲基化DNA——“两面刃”的抑制力量
研究还发现，通过构建不同甲基化状态的半甲基化双链DNA（dsDNA）模型，研究揭示非靶标链(Non target strand, NTS)-半甲基化的DNA在Cas12a反式切割中产生显著抑制效应，且这种抑制效果接近完全甲基化DNA，而靶标链(target strand, TS)-半甲基化DNA的抑制作用较弱（图3）。结构模型进一步显示，因NTS-半甲基化DNA在Cas12a-gRNA-dsDNA三元复合物中的构象偏移较大，从而更强烈地抑制Cas12a活性。
图3. 半甲基化双链 DNA 调控 Cas12a 反式切割活性的结构基础
结构揭秘：5mC修饰——“能量差异”下Cas12a的动力学转变
通过FRET检测法，研究揭示了5mC修饰对Cas12a复合物构象的显著影响。结果表明，5mC修饰的双链DNA（dsDNA）相较未甲基化DNA展示了更高的能量转移效率（图4），而5mC修饰的单链DNA（ssDNA）则表现出较低的能量转移效率。这些结果表明，5mC修饰在dsDNA和ssDNA中的影响截然不同，显著改变了Cas12a复合物的结构动力学，并且不同Cas12a变体的反应差异显著。
图4. 基于 FRET 分析 5mC 修饰与未修饰双链 DNA–Cas12a-gRNA 复合物的构象差异
临床前景：Cas12a检测甲基化cfDNA——突破“隐形门槛”实现早期诊断
研究表明，Cas12a系统能够成功区分健康个体和癌症患者的cfDNA甲基化状态。通过优化反应系统，研究团队选用了FnCas12a作为核心，结合双gRNA设计，在100 fM的甲基化DNA中成功进行检测，并在血浆样本中成功地区分甲基化和未甲基化DNA。进一步验证显示，低至1%的甲基化DNA即可显著抑制Cas12a活性，且该方法在肺癌和胰腺癌患者的cfDNA检测中展现出显著差异 （图5）。
图5. Cas12a 检测体系实现肿瘤患者与健康供者 cfDNA 的有效区分
临床意义：从一管血侦察肿瘤标志物我们一直在行动
本研究首次系统性揭示了DNA甲基化修饰对CRISPR-Cas12a反式切割活性的抑制作用，并深入解析了其构象调控机制，创新性地开发了CRISPR-MeDNA Test，一种无需扩增、快速响应的液体活检技术。未来，课题组将继续深耕肿瘤早期筛查领域，致力于推动“更早、更快、更方便”的肿瘤早筛方法，让血液中的微弱癌症信号犹如“明火藏于黑夜”，无处藏匿，提前揭示癌症的蛛丝马迹，为癌症的早期诊断与精准治疗贡献力量。
来源：新浪财经
