摘要：在生命科学、医学诊断和食品检测等领域，精确测量细胞内的能量分子是理解生命状态的关键。除了广为人知的ATP（三磷酸腺苷），其直接前体------AMP（一磷酸腺苷）的水平同样是至关重要的代谢指标。AMP/ATP比值是细胞能量状态的"敏感晴雨表"，能即时反映细胞的

在生命科学、医学诊断和食品检测等领域，精确测量细胞内的能量分子是理解生命状态的关键。除了广为人知的ATP（三磷酸腺苷），其直接前体------AMP（一磷酸腺苷）的水平同样是至关重要的代谢指标。AMP/ATP比值是细胞能量状态的"敏感晴雨表"，能即时反映细胞的能量压力。AMP检测试剂盒的出现，使我们能够便捷、高灵敏地定量这一关键分子。那么，它的背后究竟隐藏着怎样的精密设计？

核心原理：一场精妙的"酶促接力赛"

AMP检测试剂盒的核心检测原理基于一个巧妙的两步酶联反应，其最终目标是将无法直接灵敏检测的AMP，通过一系列转化，"变身"为易于检测且信号可被放大的物质。整个过程就像一场精心设计的接力赛。

第一步：从AMP到ADP------激活"第一棒"

AMP本身无法直接进入常规的能量检测循环。因此，检测的第一步是将其"激活"。这一过程由腺苷酸激酶催化完成。

反应式：AMP + ATP → 2 ADP

作用：AK利用一分子ATP作为磷酸基团的供体，将一分子AMP磷酸化，生成两分子的ADP。

意义：这一步巧妙地将待测的AMP分子与能量货币ATP联系起来，并将其转化为能量代谢通路中的中间产物ADP，为进入下一步关键反应做好了准备。

第二步：从ADP到ATP并产生可检测信号------冲刺与"发光"

生成的ADP会立即进入一个高度灵敏且成熟的检测系统。这个系统通常由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶组成一个循环反应，通过监测NADH的消耗来定量ATP（即间接定量最初的AMP）。

反应链：

PK反应：ADP + 磷酸烯醇式丙酮酸 → ATP + 丙酮酸

丙酮酸激酶利用PEP的高能磷酸键，将ADP重新转化回ATP，同时生成丙酮酸。

LDH反应：丙酮酸 + NADH + H⁺ → 乳酸 + NAD⁺

乳酸脱氢酶催化丙酮酸还原为乳酸，同时必须消耗一分子NADH，并将其转化为NAD⁺。

信号读取的关键：

在这个循环中，NADH是信号的"载体"。NADH在340 nm波长下有强吸收峰，而其氧化产物NAD⁺则没有。因此，随着反应的进行，溶液中的NADH浓度不断下降，其在340 nm下的吸光度值也会随之线性降低。

这个吸光度下降的速率，与反应中消耗的NADH量成正比，而消耗的NADH量又与第二步中生成的ATP量（即第一步中生成的ADP量）成正比，最终与样本中最开始的AMP浓度成正比。

检测流程一览以UA-Glo® AMP Assay Kit UA079024为例

1. 酶反应实验设定：

1)在96孔或384孔白不透明实验板中进行酶反应。建议96孔板反应体积为25μL，384孔板反应体积为5μL。可以在酶反应中加入浓度梯度的测试化合物。

2)酶和底物浓度需要根据不同的酶反应进行优化。在实验所需的适当信噪比的情况下，可以采用在信号线性反应范围的酶浓度进行实验。由于AMP检测试剂盒的高度灵敏性，酶用量可以极大降低。

3)如果酶反应需要ATP，应使用高纯度的ATP以获得最优实验结果。一些市售ATP含有ADP残余，由于AMP检测试剂盒的高度灵敏性，ATP中的ADP残余会导致高实验背景，因此酶反应需使用高纯度的ATP。可以使用试剂盒自带ATP，或其他高纯度ATP，例如Sigma-Aldrich所售ATP (Cat# A2383, 纯度≥99%) 或其他更高纯度的ATP。

4)酶反应可以采用文献报道的反应缓冲液和辅助因子或根据特定实验设定优化后的条件。

5)酶反应的温度和时间需根据不同的酶而设定。进行化合物高通量筛选实验时，建议优化酶反应于室温（22℃-25℃）进行，以利于在AMP检测过程中保持实验板的温度均一性。

6)酶反应结束后不需要加入额外试剂终止酶反应。如果因特殊实验要求需要加入酶反应终止试剂，避免使用镁离子螯合剂，例如EDTA。AMP检测反应需要镁离子，最终镁离子的浓度必须至少为5mM。

2. 酶反应后AMP到ADP的转化和ATP的去除

1)取出AMP GR试剂，平衡至室温（22℃-25℃）。轻摇混匀【注1 2 3】。

2)如果酶反应是在非室温，例如30℃进行反应的，平衡实验板至室温【注4】。

3)加25 µL的AMP GR试剂到以上25 µL 96-孔实验板中（总体积50µL）, 或5 µL AMP GR试剂到5 µL 384-孔实验板中（总体积10µL）。振荡混匀【注5】。

4)室温孵育40分钟。

3. 酶活性测定

1)取出 AMP检测试剂，平衡至室温。轻摇混匀【注4】。

2)加50 µL的AMP检测试剂到以上50 µL 96-孔实验板中, 或10 µL AMP检测试剂到以上10 µL 384-孔实验板中，振荡混匀。室温暗处孵育30分钟。

3)可以在加入AMP检测试剂后30-180分钟或更长读取发光信号【注6】。

注意事项

1)首次使用试剂后应分装并于-20℃及以下避光储存，保证试剂的稳定性。

2)长期保存于-20℃的AMP检测试剂解冻至室温后可能会有少许沉淀，可以直接使用上清试剂或离心去除沉淀后使用。

3)不同批次不建议混用。

4)AMP检测试剂中的荧光素酶反应对温度变化敏感。试剂和测试样品/实验板需要平衡到室温（22℃-25℃），测试过程温度保持恒定（±1℃）。

5)非经验证，不建议改变反应试剂用量。酶反应，AMP GR试剂和AMP检测试剂的体积比应为1：1：2。

6)发光信号非常稳定，3hr内信号强度基本不变。

7)本产品仅作科研用途。

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来源：优爱生物