小麦自发免疫多抗基因WAI-B2

摘要：小麦是全球最重要的粮食作物之一，其产量常受到多种活体营养型病原菌引发的病害威胁，包括条锈病、叶锈病、秆锈病和白粉病。鉴定并克隆具有多病害抗性的基因，对于培育广谱抗病小麦品种具有重要价值。小麦自身免疫(Wheat Autoimmunity, WAI)突变体即使在

小麦是全球最重要的粮食作物之一，其产量常受到多种活体营养型病原菌引发的病害威胁，包括条锈病、叶锈病、秆锈病和白粉病。鉴定并克隆具有多病害抗性的基因，对于培育广谱抗病小麦品种具有重要价值。小麦自身免疫(Wheat Autoimmunity, WAI)突变体即使在无病原菌侵染的情况下，也会表现出组成型激活的防御反应，表现过敏反应(hypersensitive response, HR)，其组织学和细胞学特征与典型的抗病反应相似，伴随活性氧(reactive oxygenspecies, ROS)爆发以及病程相关(pathogenesis-related, PR)基因的上调表达。因为植株及其叶片会自发出现类似叶斑病的症状，因此又常被称为“类病斑(lesion mimic)”现象。WAI基因通常参与细胞发育、细胞凋亡、胁迫耐受和抗病等过程，在培育广谱、多病害抗性品种方面具有巨大潜力。

2025年10月28日，湘湖实验室(农业浙江省实验室)小麦抗病生物学团队联合中国科学院遗传与发育生物学研究所、南京农业大学、北京大学现代农业研究院、河北农业大学、宁夏农林科学院和四川省农科院等单位在Advanced Science上在线发表了题为“A Transmembrane Protein WAI-B2 Confers Multiple Disease Resistance in Wheat by Activating Autoimmunity”的研究论文。

该研究报道了从小麦EMS诱导的自身免疫突变体8P4087中克隆到小麦自身免疫多抗基因WAI-B2(wheat autoimmunity-B2)，并明确了该基因在抵抗多种小麦叶部病害中的作用。WAI-B2基因编码一种独特的跨膜蛋白，该蛋白可使小麦对白粉病、条锈病、叶锈病和秆锈病产生抗性。研究表明，WAI-B2能与小麦热休克蛋白TaHsp90和TaHsp70发生相互作用，而这种相互作用对细胞稳定、信号转导及程序性细胞死亡(Programed cell death, PCD)至关重要。进一步利用AlphaFold2和SWISS-MODEL预测了最佳氨基酸替换位点及氢键相互作用位点，设计出一系列新的WAI-B2等位基因，并获得了能在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片中引发轻度细胞死亡的新等位基因。该研究为未来借助人工智能(AI)辅助手段培育抗病作物提供了宝贵思路。

1. WAI突变体8P4087的表型鉴定

WAI突变体8P4087来源于冬小麦品种“农大399”(ND399)的EMS诱变群体，表现出叶片自发形成病斑的表型。与野生型(WT)ND399相比，8P4087的坏死表型在三叶期从初生叶片开始出现，并逐渐扩散至整个植株的叶片(图1A)。3,3'-二氨基联苯胺(DAB)染色结果显示，8P4087叶片呈现深棕红色，表明其过氧化氢(H₂O₂)积累量显著高于野生型(图1B)。此外，台盼蓝染色结果显示，8P4087叶片的细胞膜通透性发生明显变化，同时伴随过敏反应(HR)、程序性细胞死亡(PCD)及活性氧(ROS)的过量积累(图1B)。

图1 “农大399”和突变体8P4087表型鉴定

将8P4087接种于MS培养基，在16℃无菌条件下培养，其幼叶仍会自发形成类病斑。与野生型相比，8P4087的株高(PH)、每穗粒数(GNS)、千粒重(TGW)和单株粒数均显著降低，但在穗长、小穗数、旗叶长度和旗叶宽度方面无显著差异。在田间人工接种条件下，8P4087在成株期对白粉病、条锈病和叶锈病均表现出抗性(图2A)；而ND399和8P4087对秆锈病均表现出抗性。

图2 “农大399”和突变体8P4087成株期对叶部病害的抗性

2. 遗传分析与图位克隆

将8P4087与普通小麦品种“百农AK58(AK58)”杂交，构建分离群体用于遗传分析。F₁代植株表现出中间表型(图2B)，表明该突变具有半显性遗传特性。对F₂代群体的遗传分析显示，叶片自发病斑表型由单个不完全显性基因控制，将该基因命名为WAI-B2。BSR-Seq分析结果表明，该突变位点定位于4B染色体长臂。利用8P4087×AK58杂交得到的809株F₂代植株作为作图群体，将WAI-B2定位在SNP标记BW2和InDel标记BW5之间的1.17 cM遗传区间内，对应中国春参考基因组(RefSeqv1.0)中205 kb基因组区域，包含8个预测的蛋白质编码基因(图3A、B)。为进一步缩小物理作图区间，对8P4087×KN9204杂交得到的2245株F₂代植株进行基因型鉴定和表型分析，最终将WAI-B2定位在SNP标记BW2和BW4之间的0.11 cM遗传区间内，对应中国春参考基因组(RefSeqv1.0)中的167 kb基因组区域，该区域包含5个预测基因(图3A、B)。

图3 WAI-B2的定位和图位克隆

对比ND399和8P4087中这5个基因的序列发现，TraesCS4B01G392100基因的第2外显子存在一个C→T单核苷酸替换，导致其编码的蛋白质第425位氨基酸由亮氨酸(Leu)突变为苯丙氨酸(Phe)(图3C)，且该突变位点位于该蛋白质的预测跨膜结构域内(图3D)。WAI-B2候选等位基因(对应TraesCS4B01G392100)仅存在于小麦4B染色体上，在中国春及其他已公布的小麦基因组序列中，4A、4D及其他染色体上均未检测到其同源基因。

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析显示，在叶片病斑表型出现前，8P4087中的WAI-B2和ND399中的野生型等位基因wai-B2的表达水平均极低；而当8P4087出现叶片病斑表型后，WAI-B2的表达水平显著高于wai-B2。此外，TaPR1基因的表达趋势与WAI-B2一致。这些结果表明，除突变位点外，8P4087的自身免疫表型还依赖于WAI-B2的上调表达(图4)。

图4 WAI-B2的表达模式

3. 转基因互补验证WAI-B2功能

为验证8P4087中突变的WAI-B2等位基因是否为叶片自发病斑表型的成因，构建了包含WAI-B2的基因组序列，并两侧分别连接2473 bp的上游启动子区域和1260 bp下游序列的互补载体。通过农杆菌介导的转化方法，将该载体导入小麦品种“Fielder”中，获得3个转基因株系。所有携带该转基因的阳性株系均表现出叶片自发病斑表型，证实表型互补成功；而Fielder则表现出正常表型(图5A)。此外，携带WAI-B2的转基因株系在成株期对白粉病、秆锈病、叶锈病和条锈病均表现出抗性，表明WAI-B2可赋予植株对多种病原菌的抗性(图5B)。

图5 WAI-B2的转基因功能验证和叶部病害抗性鉴定

qRT-PCR分析显示，在叶片病斑表型出现前，转基因株系中WAI-B2的表达水平虽极低，但显著高于Fielder中wai-B2等位基因的表达水平；而当叶片病斑表型出现后，转基因株系中WAI-B2的表达水平显著升高。此外，转基因株系中TaPR1基因的表达趋势与WAI-B2一致。

4. WAI-B2的亚细胞定位

为分析WAI-B2和wai-B2蛋白的亚细胞定位，分别将二者与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合，并通过农杆菌浸润法在本氏烟草叶片中与p35S::WAI-B2-mCherry共表达。共聚焦激光扫描显微镜观察结果显示，p35S::WAI-B2-EGFP和p35S::wai-B2-EGFP的绿色荧光均与p35S::WAI-B2-mCherry的红色荧光共定位，表明Leu→Phe突变未改变该蛋白的亚细胞定位。此外，荧光信号在细胞质中呈点状分布，并定位于高尔基体(图6A)。

为进一步分析跨膜区域对亚细胞定位的影响，根据跨膜结构域将WAI-B2分为两部分：N端(1-440位氨基酸)和C端(413-451位氨基酸)，两部分均包含WAI-B2的413-440位跨膜区域。将这两个序列插入pCAMBIA1300载体中35S启动子的下游，并分别与EGFP或mCherry融合，通过农杆菌浸润法在本氏烟草叶片中进行共表达。结果显示，p35S::WAI-B2-N-mCherry与p35S::WAI-B2-EGFP共定位；而p35S::WAI-B2-C-mCherry不仅与p35S::WAI-B2-EGFP共定位，还与细胞膜和核膜共定位。此外，荧光信号在细胞质中呈点状分布，并定位于高尔基体(图6B)。

图6 WAI-B2的亚细胞定位

为进一步验证WAI-B2蛋白的亚细胞定位，将载体WAI-B2-163UBI-mCherry与WAI-B2-163UBI-EGFP、wai-B2-163UBI-EGFP共同转染小麦叶肉原生质体。结果显示，大部分绿色荧光信号呈碎片化分布，但在部分原生质体中仍表现出共定位，且定位于高尔基体。结合WAI-B2为跨膜蛋白的预测结果，推测该蛋白可能参与胁迫响应和PCD过程中的信号传导与运输。

5. WAI-B2与TaHsp90和TaHsp70相互作用

为进一步探究WAI-B2诱导类HR反应的机制，通过免疫沉淀结合质谱(IP-MS)技术解析了WAI-B2的互作组。将WAI-B2-pS1300-EGFP和wai-B2-pS1300-EGFP载体在本氏烟草叶片中表达，鉴定出两个与WAI-B2互作的热休克蛋白：NbHsp90和NbHsp70。以中国春同源基因TraesCS5D01G268000(TaHsp90)和TraesCS3D01G352400(TaHsp70)的序列为模板设计引物，从8P4087中扩增得到TaHsp90和TaHsp70。随后通过亚细胞定位、荧光素酶互补成像(LCI)和免疫共沉淀(Co-IP)实验，证实WAI-B2可与TaHsp90和TaHsp70相互作用。

将p35S::WAI-B2-EGFP与红色荧光蛋白标记的TaHsp70和TaHsp90标记物共表达，结果显示p35S::WAI-B2-EGFP与二者均存在零星共定位(图7A)。在本氏烟草叶片中进行的LCI实验进一步证实了这些相互作用：当cLuc-WAI-B2和cLuc-wai-B2分别与TaHsp70-nLuc和TaHsp90-nLuc共表达时，可观察到强荧光信号(图7B)。然而，TaHsp70和TaHsp90的共伴侣蛋白TaDnaJ无法与cLuc-WAI-B2或cLuc-wai-B2相互作用。此外，通过本氏烟草叶片LCI实验还检测到TaHsp90-nLuc与cLuc-TaHsp70之间的蛋白相互作用(图7B)。体外Co-IP实验表明，WAI-B2-pS1300-EGFP和wai-B2-pS1300-EGFP可分别与TaHsp90-Myc和TaHsp70-Myc发生共免疫沉淀(图7C)。此外，qRT-PCR实验显示，TaHsp70和TaHsp90的表达模式与WAI-B2相似。这些结果表明，WAI-B2可能通过与TaHsp90和TaHsp70相互作用，在植物先天免疫中发挥作用。

图7 WAI-B2与TaHsp70和TaHsp90互作

6. WAI-B2同源基因的进化分析

通过小麦基因组同源序列比对，在已测序的普通小麦基因组中鉴定出WAI-B2的3种单倍型：Hap-1为唯一表现出自身免疫表型的WAI-B2；Hap-2(wai-B2)对应“Fielder”、“Norin61”、“西农6028”、“扬麦158”等品种；Hap-3对应“中国春”、“AK58”、“KN9204”等品种。利用公开的小麦族(Triticeae)基因组数据对WAI-B2同源基因进行比较分析，结果显示wai-B2仅存在于普通小麦、野生二粒小麦、硬粒小麦的4B染色体和S基因组中，表明wai-B2可能起源于S基因组(图S9A)。

图9 WAI-B2同源蛋白的聚类分析

在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)和水稻(Oryza sativa)中搜索wai-B2同源蛋白，仅玉米中的Zm00001d052636与wai-B2的序列一致性超过50%；与wai-B2同源性最高的水稻蛋白为LOC_Os11g34090.1，序列一致性为41%；拟南芥中同源性最高的蛋白为AT3G50120，序列一致性为33%。值得注意的是，所有这些同源蛋白均被注释为“功能未知的跨膜蛋白”。系统发育树分析进一步表明，wai-B2是小麦族中特有的蛋白，与拟南芥、玉米和水稻中的蛋白相似性较低(图9B)。

7. 人工智能辅助设计WAI-B2变体

为探究WAI-B2的生物学功能，并评估WAI-B2-EGFP融合蛋白是否影响其功能，在本氏烟草中进行了细胞死亡实验。结果显示，过表达WAI-B2-EGFP可在接种后72小时(72 hpi)诱导本氏烟草产生类HR反应，而转入wai-B2-EGFP载体的叶片未表现出类HR表型(图10)。

由于突变位点(L425F)周围为亮氨酸残基(L424L425L426)，对L424和L426位氨基酸进行定点突变，构建WAI-B2L424F和WAI-B2L426F变体，并在本氏烟草叶片中表达。结果显示，这两种变体均未诱导类HR表型(图10)，表明WAI-B2蛋白的第425位氨基酸残基是其自身免疫功能的关键位点。

图10 WAI-2变体设计及其诱导本氏烟叶片细胞死亡的验证

为进一步探究第425位氨基酸的其他变异对WAI-B2自身免疫功能的影响，设计了更多变体以改变该位点的相互作用特性，并在本氏烟草叶片中进行功能测试。结果显示，WAI-B2L425W、WAI-B2L425Y和WAI-B2L425N均能引起细胞坏死，但HR严重程度不同；而WAI-B2L425D、WAI-B2L425H和WAI-B2L425V未诱导类HR反应(图10)。这些结果进一步证实，第425位氨基酸残基对WAI-B2在本氏烟草中异源表达时诱导细胞死亡样反应至关重要；且该位点不同氨基酸替换导致的细胞坏死程度差异，进一步凸显了该位点的重要性。这些结果为通过引入新的氨基酸替换来人工改造WAI-B2功能提供了理论基础。

8. 讨论

抗病性是作物育种中最重要的性状之一。大多数植物抗病基因属于复杂基因家族，例如细胞内NLR类受体或细胞外膜锚定的类受体蛋白(RLPs，若包含细胞内激酶结构域则称为RLKs)。然而，病原菌不断发生突变和进化，常通过产生新的毒性小种来克服单一抗病基因的作用。相比之下，物种非特异性或小种非特异性的广谱抗病基因可提供长期、持久的多病原菌抗性。该研究证实，WAI-B2编码一种独特的跨膜蛋白，可触发小麦自身免疫反应，从而赋予小麦对多种病原菌的抗性。

小麦跨膜蛋白相关的信号通路被证实可赋予植株广谱多病原菌抗性，跨膜蛋白的位点突变可能导致底物积累，引发渗透压失衡，进而激活免疫反应。如Lr34/Yr18/Sr57/Pm38/Ltn1和Lr67/Yr46/Sr55/Pm46/Ltn3等基因编码的跨膜蛋白可对叶锈病、条锈病、秆锈病和白粉病提供部分但持久的抗性；又如小麦水通道蛋白TaPIP210通过积累H₂O₂激活免疫反应，增强对白粉病和赤霉病的抗性。

研究发现，过表达WAI-B2基因会导致小麦原生质体破裂以及本氏烟草细胞坏死；此外，WAI-B2跨膜区域第425位氨基酸的多种变体均可在本氏烟草中触发免疫反应并导致坏死。这些结果表明，WAI-B2的位点突变可能引起渗透压失衡，干扰正常的PCD进程，从而激活免疫反应。对其功能的进一步探究，有望揭示自发免疫反应和主动防御信号通路的更多调控机制。

植物免疫系统激活的自身免疫反应可抵御多种活体营养型病原菌，但同时也会对植物生长发育产生显著影响。例如，水稻rbl1突变体对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)和细菌性病原菌稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)均表现出广谱抗性，但这种抗性是以产量降低为代价的。通过多重基因组编辑策略，研究人员成功培育出可保留免疫功能且不影响产量的优良等位基因：缺失突变体RBL1Δ12在生育期仅表现出轻微坏死，同时保留稻瘟病抗性且无产量损失。这些结果表明，通过精细调控抗病基因可实现免疫与产量的平衡，为培育广谱抗病新品种提供了新思路。在小麦中，WAI-B2的L425F位点突变虽能赋予植株对多种活体营养型病原菌的抗性，但同时也会触发强烈的HR反应，导致小麦叶片坏死。通过优化WAI-B2蛋白第425位氨基酸的替换类型，筛选出一个较弱的等位基因WAI-B2L425N，该变体在本氏烟草叶片中仅诱导轻微坏死。基于这一发现，可利用引导编辑(prime editing)技术对WAI-B2基因进行精准的单碱基替换，从而培育出具有广谱抗性且无显著产量损失的新型等位基因。该策略为通过智能设计实现小麦产量与抗病性的平衡提供了新途径。

湘湖实验室(农业浙江省实验室)小麦抗病生物学团队博士后李雯玲和助理研究员陈永兴为论文的共同第一作者；湘湖实验室吴秋红研究员、南京农业大学贾海燕教授和中国科学院遗传与发育生物学研究所刘志勇和赵玉胜研究员为共同通讯作者。这项研究得到了浙江省重点研发计划、中国科学院先导计划和国家自然科学基金等项目的资助。

论文链接：

Li W., Chen Y., Dong L., et al. (2025) A transmembrane protein WAI-B2 confers multiple disease resistance in wheat by activating autoimmunity. Advanced Science e11576. https://doi.org/10.1002/advs.202511576

小麦族多组学网站：http://wheatomics.sdau.edu.cn

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