摘要：当我们在讨论后疫情时代时，mRNA疫苗无疑是聚光灯下的主角。然而，在这场革命背后，有一个沉默的功臣，脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNP）。它就像一个技术精湛的“纳米快递员”，将脆弱的mRNA分子安全、高效地送入我们体内的细胞中。从M
当我们在讨论后疫情时代时，mRNA疫苗无疑是聚光灯下的主角。然而，在这场革命背后，有一个沉默的功臣，脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNP）。它就像一个技术精湛的“纳米快递员”，将脆弱的mRNA分子安全、高效地送入我们体内的细胞中。从Moderna的Spikevax到辉瑞/BioNTech的Comirnaty，再到首个获批的siRNA药物Onpattro，LNP技术已经从一个充满希望的科学概念，蜕变为价值数百亿美元的临床现实。
我们似乎已经熟悉了它的成功故事。然而，一个令人困惑的问题始终萦绕在药物研发人员的心头：为什么基于相似配方、甚至是相同配方的LNP，其在生物体内的表现却可能天差地别？为什么我们投入巨大努力设计的下一代LNP，其性能往往如同购买彩票，充满了不确定性？这种“试错”式的研发模式，不仅成本高昂，更严重阻碍了核酸药物领域的创新步伐。
长久以来，我们评估这些“纳米快递员”的方式，或许从一开始就存在着视野上的盲区。我们习惯于使用一些传统技术，比如动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS），来测量它们的平均尺寸和分散性。但这就像试图通过全班同学的平均身高，来判断每个个体的运动能力一样，得到的信息是模糊且具有误导性的。我们看到的是一个“平均”的LNP，却忽略了群体内部巨大的异质性。
10月23日，《Nature Biotechnology》的研究报道“Elucidating lipid nanoparticle properties and structure through biophysical analyses”，为我们揭开这个“隐秘世界”的一角，提供了前所未有的高清视角。研究人员利用一系列生物物理学分析技术，如同为LNP的“体检”引入了核磁共振和高分辨率CT，让我们得以超越“平均值”的迷雾，直视LNP群体内部的真实多样性，并首次有力地揭示了决定其递送效能的深层物理密码。这不仅是一项技术的展示，更是一次对LNP设计理念的深刻反思与重塑。
在评价一个LNP制剂的优劣时，我们通常会关注几个宏观指标：尺寸（size）、多分散性指数（Polydispersity Index, PDI）、Zeta电位（zeta potential）以及药物的包封率（encapsulation efficiency）。而测量这些指标的“老三样”工具，主要是动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM），以及一些基于荧光染料的包封率测定方法，如RiboGreen分析法。
这些方法无疑为LNP的初步表征做出了巨大贡献，但它们的局限性也日益凸显，成为我们理解LNP构效关系的巨大障碍。
首先，DLS是目前应用最广泛的粒径测量技术。它的原理是基于颗粒在溶液中的布朗运动来推算流体力学半径（hydrodynamic radius, Rh）。然而，DLS存在一个致命的缺陷：它的信号强度与颗粒半径的六次方成正比。这意味着，样品中只要有少量的大颗粒或聚集体，其产生的散射信号就足以掩盖大量小颗粒的真实信息。最终，我们得到的只是一个“强度加权”的平均值，它严重偏向于大颗粒，而对于样品中可能存在的多个不同大小的亚群，DLS的分辨能力非常有限，几乎无法区分。这就好比在嘈杂的交响乐中，我们只能听到音量最大的铜管乐器，却错过了弦乐和木管的细腻旋律。
其次，冷冻透射电镜（cryo-TEM）虽然能提供直观的形态学图像，让我们亲眼看到LNP的模样，但它同样存在“幸存者偏差”。为了成像，LNP样品需要被快速冷冻固定在载网上，这已经脱离了它们在生理溶液中的真实状态。更重要的是，cryo-TEM无法有效地区分哪些LNP内部成功装载了mRNA，哪些又是空空如也的“幽灵颗粒”。这并非杞人忧天，近期的研究已经指出，一个LNP制剂中，高达80%的颗粒可能都是没有装载任何有效载荷的“空壳”。
而传统的RiboGreen荧光法在测定包封率时，也面临着相似的困境。它通过比较LNP被表面活性剂破坏前后溶液的荧光强度差异，来计算包封在内部的RNA含量。但这个方法测量的同样是一个总体值，它无法告诉我们这批LNP中，是所有颗粒都装了一点点RNA，还是少数颗粒装得满满当当，而大部分颗粒是空的。RNA在LNP群体中的装载异质性（loading heterogeneity）信息，就这样被完全抹去了。
这些传统方法的共同特点是“均质化”和“平均化”。它们将一个inherently polydisperse（内在多分散）的复杂群体，简化成几个单一的数值。依赖这些模糊的数据去建立LNP的结构与生物学功能之间的关联，无异于管中窥豹。我们可能因为一个看似理想的“平均粒径”，而忽略了其中致命的大颗粒聚集体；也可能因为一个漂亮的“总体包封率”，而掩盖了大部分颗粒无效的事实。
因此，当前的LNP研发常常陷入一种“玄学”般的困境：我们根据这些宏观参数优化了配方，却发现生物学效果的改善微乎其微，甚至毫无关联。很显然，要实现LNP的“理性设计”，我们迫切需要新的工具，能够穿透“平均值”的迷雾，为我们呈现LNP群体内部每一个亚群，甚至是每一个颗粒的真实物理化学特性。这正是该研究的核心突破所在。
为了实现对LNP群体前所未有的高分辨率解析，研究人员巧妙地组合了三种先进的、基于溶液的（solution-based）生物物理学技术。这些技术均在“label-free”的条件下进行，即无需对LNP或其内容物进行荧光标记，从而最大程度地保留了样品的原始状态。它们就像三台功能互补的精密仪器，从不同维度对LNP进行了一次彻底的“深度体检”。
第一大利器：沉降速度分析超速离心（Sedimentation Velocity Analytical Ultracentrifugation, SV-AUC）， LNP的“密度扫描仪”
想象一下，我们将LNP样品置于一个强大的离心场中。根据基本的物理学原理，密度较大的物体会更快地沉降（sedimentate），而密度较小的物体则会浮起（float）。SV-AUC正是利用了这一原理。mRNA分子的密度远高于脂质，因此，成功装载了大量mRNA的LNP，其整体密度会显著增加。
通过实时监测LNP在离心过程中的移动速度和位置，SV-AUC能够精确地解析出样品中不同沉降系数（sedimentation coefficient, S）的组分分布。沉降系数为正值的组分代表正在下沉的颗粒（即成功装载mRNA的LNP），而沉降系数为负值的则代表正在上浮的颗粒（即空的或载量极低的LNP）。
SV-AUC的巧妙之处在于，它将传统表征中模糊不清的“包封率”概念，转化为了一个清晰可见的、定量的分布图。我们不再只有一个笼统的百分比，而是能直观地看到样品中“实心”颗粒和“空心”颗粒的相对丰度，以及它们各自的分布情况。这对于评估LNP制备工艺的均一性和有效性至关重要。
第二大利器：场流分离-多角度光散射联用技术（Field-Flow Fractionation - Multi-Angle Light Scattering, FFF-MALS）， LNP的“一体化分析平台”
如果说SV-AUC是密度专家，那么FFF-MALS就是一个全能型选手。它首先通过场流分离（FFF）技术对LNP样品进行温和而高效的分离。与传统的尺寸排阻色谱（Size-Exclusion Chromatography, SEC）不同，FFF在一个开放的通道中进行分离，没有固定相填料。这避免了LNP与填料发生相互作用可能导致的颗粒剪切、聚集或降解，尤其适合分析结构敏感的纳米颗粒。
当不同大小的LNP被FFF成功分离，并依次流出通道后，它们会立即进入一系列在线检测器，其中最核心的是多角度光散射检测器（MALS）。MALS可以极其精确地测定每个时间点流出颗粒的绝对摩尔质量（molar mass）和回旋半径（radius of gyration, Rg）。同时，联用的紫外（UV）检测器和示差折光（RI）检测器，可以分别测定RNA和脂质的浓度。
将这些信息整合起来，FFF-MALS就能在一次运行中，为我们描绘出一幅详尽的LNP图谱。我们不仅能知道整个样品中存在哪些不同大小的亚群，还能知道每一个亚群的精确质量、尺寸、以及其内部RNA和脂质的比例。这种“尺寸分辨的成分分析”能力，是传统方法无法企及的。它使我们能够探究，在同一个LNP制剂中，是不是大颗粒总是比小颗粒装载了更多的RNA？或者情况恰恰相反？这些精细的信息对于理解LNP的生物学行为至关重要。
第三大利器：联用同步辐射小角X射线散射的尺寸排阻色谱（SEC-SAXS）， LNP的“内部结构探测器”
在了解了LNP的密度、尺寸和宏观组成之后，我们自然会好奇：在纳米尺度下，这些“快递盒”内部的RNA“货物”究竟是如何打包的？它们是随意堆放，还是以某种有序的结构排列？解答这个问题，就需要借助SAXS这双“X射线眼睛”。
小角X射线散射（SAXS）是一种强大的结构生物学技术，它通过分析样品对X射线的散射图形，来获取物质在1-100纳米尺度范围内的结构信息。当X射线穿过LNP时，如果其内部的RNA和脂质形成了规整的、重复性的结构（例如，RNA链与脂质分子层层堆叠），就会在特定的散射角度上产生一个特征性的“布拉格峰”（Bragg peak）。这个峰的位置反映了重复结构的间距，而峰的强度则与结构的有序程度和占总体积的比例正相关。一个更尖锐、更强烈的布拉格峰，通常意味着RNA和脂质之间形成了更紧密、更有序的复合物。
通过将SAXS与SEC联用，研究人员可以获得属于不同尺寸LNP亚群的、纯净的SAXS信号，从而揭示LNP内部结构的尺寸依赖性。更进一步，利用先进的算法对SAXS数据进行“从头算重构”（ab initio reconstruction），甚至可以重建出LNP在溶液中的三维电子密度图，从而直观地展示其真实形状，它们究竟是完美的球体，还是像橄榄球一样的椭球体？
这三大利器，从密度、尺寸、组成、内部有序结构到三维形状，为我们构建了一个观察LNP的、前所未有的多维度、高分辨率分析体系。手握这些强大的工具，研究人员得以重新审视那些被认为是“黄金标准”的LNP配方，而他们所看到的，彻底颠覆了我们过去的认知。
研究人员选择了四种具有里程碑意义的、临床上或学术上公认的“黄金标准”可电离脂质来构建LNP文库：MC3（用于首个siRNA药物Onpattro）、SM-102（用于Moderna新冠疫苗）、ALC-0315（用于辉瑞/BioNTech新冠疫苗）以及C12-200（一种广泛使用的学术研究标准品）。对于每一种脂质，他们都采用了两种不同的制备方法：传统的“本体混合”（bulk mixing，即简单的移液器混合）和现代的“微流控”（microfluidic）技术。
当他们用这套全新的分析体系审视这些LNP时，一幅幅复杂而生动的画卷徐徐展开。
微流控 vs. 本体混合：一场并非“一边倒”的较量
普遍的认知是，微流控技术通过在微米尺度的通道中实现快速、可控的流体混合，能够生产出粒径更小、分布更均一的LNP。传统表征数据也初步证实了这一点。例如，微流控制备的LNP，其mRNA浓度普遍在40-60 ng/μL，包封率高于80%；而本体混合的LNP，mRNA浓度则只有10-30 ng/μL，包封率约50%。DLS测量的流体力学半径（Rh）也显示，微流控LNP（约40 nm）普遍小于本体混合的LNP（约100 nm）。
然而，当更精密的分析工具介入时，一个引人深思的“反例”出现了。在针对人类原代T细胞的体外转染实验中，对于MC3、SM-102和ALC-0315这三种脂质，微流控LNP的mRNA表达效率（以荧光素酶发光强度衡量）确实比本体混合的版本高出2到3倍，符合预期。但令人意外的是，对于C12-200，结果却完全相反：本体混合制备的C12-200 LNP，其转染效率竟然比微流控版本高出近三倍！
这个出乎意料的结果是一个强烈的信号：制备方法与脂质种类的选择之间存在着复杂的相互作用。“微流控一定更好”这个看似金科玉律的信条，至少在C12-200这里被打破了。这背后一定隐藏着更深层次的物理化学机制，是传统表征方法无法触及的。
揭开“空壳”与“实心”的秘密：SV-AUC下的群体写真
SV-AUC的分析为我们揭示了不同LNP群体内部的载荷异质性。分析显示，对于MC3、SM-102和ALC-0315这三种LNP，其绝大部分质量（在g*(s)分布图中表现为S值为0到-200 Svedberg的峰）都呈现出“上浮”的趋势。这有力地证明，这些制剂中含有大量空的或mRNA载量非常低的LNP颗粒。
相比之下，C12-200 LNP则表现出截然不同的行为，它们绝大部分质量（S值为0到约100 Svedberg）都“沉降”了。这表明C12-200配方能够更均匀、更有效地将mRNA包裹进去，形成的“实心”颗粒比例远高于其他三种。这种差异与四种可电离脂质本身的密度（MC3密度最低，C12-200密度较高）趋势相符，显示了SV-AUC对LNP载荷情况的精确洞察力。
更有趣的是，在每一种配方中，微流控制备的样品都比本体混合的样品展现出更窄的沉降/上浮分布峰，这意味着微流控技术确实能够生产出载荷情况更为均一的LNP群体。
超越球形假说：LNP的真实三维形状
长期以来，为了简化模型，我们常常假设LNP是完美的球体。然而，SEC-SAXS的分析数据，经过DENSS算法的重构，向我们展示了它们的真实面貌。研究发现，所有四种微流控LNP在溶液中的形态，都不是完美的球体，而是呈现出长椭球体（prolate ellipsoidal）的形态，就像一颗颗微型的橄欖球。
这一发现意义重大。与同等体积的球体相比，椭球体具有更高的表面积-体积比。这意味着它们有更大的表面积可以与细胞膜发生相互作用，这可能直接影响细胞对LNP的摄取效率。同时，颗粒的形状也被证明会影响它们在血液循环中与蛋白质形成的“蛋白冠”（protein corona），以及被免疫系统识别和清除的方式。将“形状”作为一个可调控的设计参数，无疑为未来LNP的优化开辟了一个全新的维度。
这些高清镜头下的发现，不仅让我们看到了LNP群体内部前所未有的复杂性和多样性，也为我们解释那个“C12-200之谜”提供了关键线索。而最终的答案，隐藏在更深的层次，LNP的内部结构中。
如果说尺寸、形状和载荷是LNP的“外在表现”，那么其内部RNA与脂质的相互作用和排列方式，则是决定其核心功能的“内在修为”。SEC-SAXS分析在这里扮演了“终极解码器”的角色。
布拉格峰的启示：内部有序性的直接量度
如前所述，SAXS图谱中的布拉格峰（Bragg peak）是LNP内部结构有序性的直接体现。一个尖锐、强烈的峰，代表着RNA与脂质形成了高度有序的、类似层状的纳米结构。研究人员系统地分析了所有LNP样品的SAXS数据，并将其与生物学活性数据进行了关联性分析（Spearman correlation）。
结果令人振奋。他们发现，无论是对于T细胞的体外转染，还是小鼠模型的静脉注射（intravenous, IV）递送，LNP的生物学效能与许多传统参数，如流体力学半径（Rh）或DLS测得的PDI，都没有明显的相关性。然而，SAXS峰的强度（intensity）和峰面积（area），却与这两种应用场景下的mRNA表达水平呈现出强烈的正相关（r > 0.6）。
这意味着，LNP内部RNA-脂质复合物的有序程度越高，其在T细胞中和通过静脉注射递送mRNA的能力就越强。这个发现，如同在迷雾中找到了一座灯塔，为我们指明了优化LNP效能的一个关键物理参数。我们终于从关注“它有多大”，转向了关注“它内部的包裹质量有多好”。
C12-200之谜的最终解答
有了这条关键线索，我们再回头看那个令人困惑的C12-200现象。研究人员比较了本体混合与微流控制备的C12-200 LNP的SAXS图谱。结果一目了然：本体混合制备的C12-200 LNP，其布拉格峰的强度，显著高于微流控制备的同类样品。
这个直接的结构证据，完美地解释了之前的生物学数据。尽管微流控C12-200 LNP在尺寸均一性上可能更优，但本体混合的制备过程，似乎以某种方式促进了C12-200脂质与mRNA之间形成更有序、更紧密的内部结构。而正是这种卓越的“内在修为”，使其最终在T细胞转染效率上胜出。
这个案例有力地证明，制备工艺并非独立于脂质化学性质的存在，二者共同决定了LNP最终的物理形态和内部结构，进而决定了其生物学命运。对于不同的脂质，最优的制备工艺可能完全不同。
情境的重要性：没有万能的 LNP
更有趣的是，这种“内部结构决定论”并非放之四海而皆准。当递送方式从静脉注射（IV）转为肌肉注射（intramuscular, IM），这是mRNA疫苗最常用的途径时，关联性发生了戏剧性的反转。SAXS峰的强度和峰面积，与IM递送的效率呈现出强烈的负相关。
这意味着，对于肌肉注射而言，一个内部结构不那么“规整”，可能更为“松散”的LNP，反而能实现更好的mRNA表达。这背后可能的原因非常复杂，或许与LNP在肌肉组织中的扩散、被不同类型的细胞（如肌细胞 vs. 抗原提呈细胞）摄取，以及后续的内体逃逸机制有关。
这一发现给我们带来了极为深刻的启示：不存在一个普适的、“最好”的LNP设计。一个在T细胞疗法中表现完美的LNP，直接用于肌肉注射疫苗，效果可能非常糟糕。LNP的“效能密码”，是与其应用的生物学情境（biological context）紧密锁定的。
这项研究通过精密的物理表征，最终指向了一个更宏大的生物学命题：LNP的递送是一个与环境动态博弈的过程，任何脱离具体应用场景的“优化”，都可能是缘木求鱼。
细胞类型的选择：T细胞 vs. 癌细胞
为了进一步验证“情境依赖性”，研究人员将这套LNP文库应用于一种名为FaDu的口腔鳞状细胞癌细胞系。结果再次印证了他们的观点。在FaDu细胞中，生物学活性的趋势与在T细胞中观察到的截然不同。除了C12-200依然是本体混合更优之外，对于MC3、SM-102和ALC-0315，本体混合制备的、尺寸更大的LNP，其转染效率反而超过了微流控版本。
研究人员推测，这可能与癌细胞独特的生物学特性有关。癌细胞通常具有极高的内吞（endocytosis）活性，它们“吞噬”外界物质的能力远强于原代T细胞。在这种情况下，颗粒的大小可能成为一个更重要的因素，较大的颗粒或许更容易被这种“贪婪”的细胞所捕获。此时，LNP内部结构的精细差异，其重要性可能就让位于简单的“能否被高效摄取”这一步。
递送途径与内体逃逸之谜
除了细胞类型，递送途径的不同也带来了巨大的变量。IV注射的LNP进入血液循环，会立即被血浆蛋白包裹形成“蛋白冠”，其最终主要被肝脏的细胞所摄取。而IM注射的LNP则面临着肌肉组织的细胞外基质、淋巴引流和局部免疫微环境。这两种情境下，LNP与生物系统互作的第一界面就完全不同。
研究还通过一系列内吞抑制剂实验，初步探讨了LNP进入T细胞的途径。结果显示，不同的LNP配方，其依赖的内吞途径（如网格蛋白介导、小窝蛋白介导或巨胞饮等）存在差异。有趣的是，制备方法也会影响LNP的“路径选择”。例如，对于某些配方，抑制某条“死胡同”式的内吞通路，反而能迫使LNP走上另一条能够成功实现内体逃逸的“康庄大道”，从而提升了最终的蛋白表达。
这一切都指向同一个结论：LNP的设计，必须从终点出发，进行“倒推式”的理性设计。我们首先要明确我们的目标细胞是什么？递送途径是哪条？期望的生物学效应是什么？然后，利用这些高分辨率的分析工具，去寻找与这个特定“情境”下的关键生物学步骤（如细胞摄取、内体逃逸）最相关的物理化学参数，并围绕这个参数进行针对性的优化。
这项开创性的研究，为LNP领域带来的不仅仅是一系列令人兴奋的新发现，更重要的是，它提供了一套全新的研究范式和设计哲学。它标志着LNP的研发，正在从依赖经验和运气的“炼金术”时代，迈向一个基于深刻物理理解和精确数据指导的“精密工程”时代。
回顾这项工作的核心洞见，我们可以为未来的LNP平台发展，勾勒出一条清晰的路径：
首先，我们必须拥抱异质性，并学会量化它。我们不能再满足于一个“平均值”。像SV-AUC、FFF-MALS和SEC-SAXS这样的高分辨率技术，应当成为LNP研发流程中，尤其是在关键候选配方筛选和工艺优化阶段，不可或缺的工具。它们提供的关于载荷分布、亚群组成、内部结构和真实形状的信息，是开启理性设计的钥匙。
其次，LNP的设计参数库需要被极大地丰富。除了传统的尺寸和表面电荷，我们现在必须将“内部有序性”、“三维形状”、“群体中空壳颗粒比例”等新的物理参数纳入考量。未来的研究，需要系统地探索如何通过调控脂质分子结构、配方组分比例以及制备工艺的参数（如流速、混合几何形状），来精确地调控这些新的设计参数。
再次，“情境”是LNP设计的最高准则。我们必须放弃寻找“万能LNP”的幻想。针对不同疾病、不同靶点、不同递送途径，甚至是不同RNA载荷（siRNA vs. mRNA，短mRNA vs. 长mRNA），都需要建立独特的构效关系模型。高通量筛选与高分辨率表征的结合，将使我们能够快速地为每一个具体应用，找到那个“最优解”，而非“通用解”。
最后，这项工作也向我们展示了基础科学与应用研究完美结合的强大力量。正是源于对胶体物理学、结构生物学和高分子科学等基础学科的深刻理解，研究人员才能够选择和运用最合适的工具，去回答药物递送这一应用领域的关键问题。
LNP的“隐秘世界”已经被打开了一道门缝，门后的景象远比我们想象的要复杂和精彩。我们看到，每一个纳米颗粒，都像是一个拥有独立个性的微小生命体，它的尺寸、形状、内部构造，共同谱写了它在生命体内的奇幻漂流记。而这项研究，正是教会了我们如何去阅读这本由物理规律书写的“命运之书”。这无疑将极大地加速下一代核酸药物的到来，为人类健康带来更多的可能性。未来的LNP，将不再是偶然的发现，而是精确的创造。
参考文献
Padilla MS, Shepherd SJ, Hanna AR, Kurnik M, Zhang X, Chen M, Byrnes J, Joseph RA, Yamagata HM, Ricciardi AS, Mrksich K, Issadore D, Gupta K, Mitchell MJ. Elucidating lipid nanoparticle properties and structure through biophysical analyses. Nat Biotechnol. 2025 Oct 23. doi: 10.1038/s41587-025-02855-x. Epub ahead of print. PMID: 41131152.
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来源：生物探索一点号1