摘要：根瘤是豆科植物与根瘤菌共生形成的“固氮工厂”，其内部被侵染的细胞中充满了负责固氮的类菌体。但固氮过程面临一个“氧气悖论”：固氮酶对氧气极为敏感，需要在微氧环境下才能发挥作用，而根瘤菌的呼吸代谢却又需要氧气。研究表明，植物通过根瘤皮层的物理氧气扩散屏障与侵染区大
根瘤是豆科植物与根瘤菌共生形成的“固氮工厂”，其内部被侵染的细胞中充满了负责固氮的类菌体。但固氮过程面临一个“氧气悖论”：固氮酶对氧气极为敏感，需要在微氧环境下才能发挥作用，而根瘤菌的呼吸代谢却又需要氧气。研究表明，植物通过根瘤皮层的物理氧气扩散屏障与侵染区大量合成的豆血红蛋白来缓冲氧浓度，从而解决这一矛盾。血红素是豆血红蛋白的关键辅基，其合成是否受宿主调控并直接影响根瘤微环境的平衡，目前尚无定论。
近日，JIPB在线发表了中国科学院遗传与发育生物学研究所杨维才院士团队题为"CPOP1 is a key enzyme required for nodule microenvironment control and successful symbiotic nitrogen fixation inLotus japonicus"的研究论文 (https://doi.org/10.1111/jipb.70037)。该研究以豆科模式植物百脉根 (Lotus japonicus) 为背景，首次揭示了宿主根瘤中特异高表达的血红素合成酶LjCPOP1对维持根瘤低氧环境和高效固氮具有关键作用。
LjCPOP1编码的粪卟啉原Ⅲ氧化酶 (coproporphyrinogen III oxidase)，是血红素合成途径的关键酶之一。在百脉根根瘤中，LjCPOP1的转录水平显著升高，在共生后约10天达到峰值；而其同源基因LjCPOP2及线粒体定位的LjCPOM基因在根瘤中表达极低，主要参与营养生长。研究首先验证了LjCPOP1在植物固氮共生中的作用：LjCPOP1敲除突变体 (cpop1) 在缺氮条件下表现出严重的氮饥饿症状，包括株高降低、叶片泛黄、花青素积累，形成的根瘤由野生型的红色 (富含血红素) 变为白色，固氮能力几乎丧失；而补充硝态氮后，植株完全恢复正常生长，表明这些缺陷源于共生固氮功能受阻 (图1)。
图1 敲除百脉根CPOP1基因使根瘤丧失固氮能力
深入分析发现，LjCPOP1的缺失虽不影响根瘤形成，但严重破坏了根瘤内的微氧环境和共生固氮过程。通过氧微电极原位测定，野生型根瘤内的氧气分压在皮层迅速下降，在侵染区几乎降为零，实现了理想的微氧状态；而cpop1根瘤的氧气梯度下降变缓，在侵染区外围仍可检测到氧气 (图2)。统计表明，cpop1根瘤内真正无氧的微氧区域显著缩小，侵染区氧浓度升高导致共生根瘤菌内氧敏感的固氮调控基因NifA2/A1表达大幅下调，进而削弱了固氮酶复合体的合成与活性。乙炔还原检测显示，cpop1根瘤的固氮活性显著降低；Western blot检测表明，cpop1根瘤中豆血红蛋白含量显著下降，而根瘤菌固氮酶NifH水平与野生型相当 (图2)。上述结果说明：LjCPOP1缺失导致宿主无法提供足够的血红素来组装稳定的豆血红蛋白，根瘤侵染区缓冲氧气的能力下降，自由氧累积过量，最终使固氮相关基因失活，固氮作用陷入瘫痪。
图2 cpop1突变体根瘤微氧区域变小，固氮活性显著下降，且血红素含量降低
有趣的是，LjCPOP1的缺失不仅影响固氮酶活性，还干扰了根瘤内共生细菌的正常增殖。通过冻裂扫描电镜和激光共聚焦显微观察，发现野生型百脉根根瘤在发育后期侵染细胞内的类菌体可继续分裂繁殖，一个共生体中常包含多个固氮菌；而cpop1突变体根瘤的大部分侵染细胞内，一个共生体仅容纳单个类菌体，未能形成多细菌共存结构。在早期根瘤中，cpop1共生细菌内多种细胞分裂相关基因的转录水平显著下调，与显微观察到的细菌分裂停滞一致。值得注意的是，在cpop1根瘤发育后期，靠近侵染细胞边缘的部分类菌体内细菌数目有所增加，而中央区域的类菌体仍以单菌存在。研究团队推测，由于LjCPOP1缺失，根瘤内只能依赖未侵染细胞和周缘区域由LjCPOP2/CPOM产生的少量血红素经扩散供给类菌体，形成由外向内递减的血红素浓度梯度；外层类菌体可能获得相对较多的血红素以支持呼吸代谢和细胞分裂，而中心区域的类菌体因血红素供应不足而停止增殖。这一发现表明，宿主血红素供应不足不仅导致根瘤微氧环境失调，也限制了根瘤内共生细菌的增殖。
为了解释LjCPOP1在根瘤中特异高表达的分子机制，研究团队对其启动子顺式调控元件进行了分析验证，发现LjCPOP1启动子在转录起始位点上游约-881～-740bp的片段对其在侵染细胞中的高活性至关重要，其中包含决定根瘤侵染细胞特异表达的关键元件。跨物种序列比对显示，这段约142bp的顺式元件仅存在于百脉根LjCPOP1启动子中，在其他豆科植物近缘物种的CPOP启动子中均无对应序列，提示该序列可能源自百脉根基因组一次独特的水平转移或片段插入事件，使LjCPOP1获得了进化上独有的共生表达调控。进一步的功能互补实验表明，LjCPOP1蛋白本身的催化功能与其他物种同源酶并无差异，其特殊作用主要来源于表达模式的差异。这说明不同物种或同一种植物内CPO酶在酶学功能上高度保守，但LjCPOP1通过获得独特的启动子元件实现了在共生固氮情境下的专一高表达，承担了调控根瘤微环境和固氮效率的关键角色。相比之下，多倍体豆科作物大豆仅拥有一个CPOP同源基因 (GmCPOP)，其在各组织中广泛表达并在根瘤中被强烈诱导。RNAi下调大豆GmCPOP的表达会导致根瘤内类菌体繁殖受限，但完全敲除则对植株生长有致命影响。这表明豆科植物CPOP基因家族在进化中产生了功能分化：部分成员 (如LjCPOP1) 专职于共生固氮，而其他同源基因则维持基本生理代谢；百脉根LjCPOP1通过启动子驯化获得了共生固氮功能的强化，代表了植物为适应高效共生固氮而发生的一种基因功能创新。
综上所述，本研究证明宿主植物可以通过调控自身血红素合成途径基因的表达来塑造根瘤内微环境，从多个层面确保共生固氮的顺利进行。LjCPOP1在百脉根根瘤侵染细胞中的专一高表达，保障了豆血红蛋白的充足和氧气梯度的维持，不仅激活了固氮酶的功能，也支持了共生菌的正常增殖。该发现不仅填补了植物血红素代谢与共生固氮调控之间的空白，也为进一步提高作物生物固氮效率提供了新思路和潜在靶点。通过基因编辑或品种改良手段针对CPOP1类似的关键调控元件进行定向优化，未来有望增强豆科作物与根瘤菌共生固氮体系的效能，减少化肥施用，促进农业绿色可持续发展。
中国科学院遗传与发育生物学研究所杨维才院士和罗昱副研究员为该论文的通讯作者，田宇芳博士、罗昱副研究员、黎绮旻硕士为共同第一作者。郭亚龙研究员和张稚钦博士参与了该研究。本项目得到国家重点研发项目、基础研究领域优秀青年团队以及中科院先导专项等项目的联合资助。
文章引用：
Tian, Y.F., Luo, Y., Li, Q.M., Zhang, Z.Q., Guo, Y.L., andYang, W.C. (2025). CPOP1 is a key enzyme required for nodule microenvironment control and successful symbiotic nitrogen fixation in Lotus japonicus. J. Integr. Plant Biol. https://doi.org/10.1111/jipb.70037
来源：科学美匠