摘要：凝胶迁移或电泳迁移率实验 (electrophoretic mobility shift assay，EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析(Hellman LM and Fried MG, 2007)。
凝胶迁移或电泳迁移率实验 (electrophoretic mobility shift assay，EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析(Hellman LM and Fried MG, 2007)。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前也可用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。在实验中，通常将纯化的蛋白或细胞粗提液和生物素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。其中DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢，而探针移动的较快。
图1. EMSA实验原理图根据实验方案设计的不同，EMSA实验可以分为验证型EMSA、竞争型EMSA和超迁移EMSA，我们需要灵活选择EMSA类型，以便深入探究核酸-蛋白质相互作用。
图2. EMSA实验类型01主要应用方向❖基因调控机制研究：揭示转录因子如何激活或抑制基因表达，例如在癌症研究中定位关键致癌蛋白（如MYC、p53）与靶基因启动子的结合位点。❖药物研发与筛选：评估小分子化合物或抗体药物对DNA-蛋白质相互作用的干扰能力，为抗炎、抗肿瘤药物设计提供靶点验证（如抑制NF-κB通路）。❖表观遗传学探索：分析组蛋白修饰、甲基化等对DNA-蛋白质互作的影响，深化对染色质结构动态调控的理解。02技术优势❖直接测定蛋白质与核酸的相互作用，提供定性和定量信息；❖可用于研究多种类型的相互作用，如特异性结合、非特异性结合、序列特异性等；技术简单，实验操作相对容易；❖可以使用不同的标记方法和检测技术进行适应不同实验需求设计探针。03探针设计在EMSA实验最关键的步骤就是设计探针，那如何设计探针呢？（1）我们需要根据基因 Y 的启动子 DNA 序列来设计探针，探针是一段 DNA 双链，序列中要包含转录因子 X 的结合序列。结合位点可通过文献或生物信息学工具（如JASPAR、MEME）预测。（2）探针长度一般是20-40 bp，包含核心结合位点及两端保护序列。（3）探针是带标记的，可以带放射性的 p32，或者非放射性的生物素或地高辛（生物素/荧光标记需纯化至高纯度（HPLC级），避免游离标记物干扰）。当检测转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白或细胞核抽提出来的蛋白。如果是用纯化的转录因子蛋白去做 EMSA，那就可以排除其他分子的干扰，证明检测出来的蛋白-DNA探针结合是直接结合。为什么要设置不同浓度梯度的探针？EMSA（电泳迁移率变动实验）的核心是观察DNA与蛋白的特异性结合，在实验开展的时候通常需要设置不同浓度梯度的探针，这是实验成功的关键：（1）确定最佳结合条件；（2）低浓度探针：可能出现结合不饱和，导致假阴性；（3）高浓度探针：非特异性结合风险增加，产生假阳性；（4）梯度设计（如50×、100×、200×）：精准锁定蛋白与DNA结合的最适摩尔比！（5）验证结合特异性；（6）竞争性实验：加入过量未标记探针（冷探针），若条带消失，说明结合是特异的；（7）突变探针对照：设计碱基突变的探针，排除非特异性干扰。EMSA实验结果及解读
图3. 金开瑞实验结果图展示（1）我司（金开瑞）阴阳对照引用自"Hellman LM and Fried MG, 2007. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols, 2(8):1849-61."（2）EMSA实验检测的是生物素信号，即生物素标记的探针，因此通常最下方会出现一列探针条带；（3）在同时加入蛋白与WT探针，且两者可以结合的情况下，探针由于结合了蛋白，电泳速率下降，因此会在上方出现迁移条带；（4）竞争型冷探针是序列与WT探针一致但没有生物素标记的探针，因此虽然其也能与蛋白结合，但无法被检测到，因此随着竞争型探针上样量增多，迁移条带会变浅或消失；（5）MT探针是结合位点序列突变后的WT探针，由于无法再与蛋白结合，所以没有出现迁移条带；有时突变后也会出现迁移条带，说明突变的序列不对，或突变不完全，需要重新设计突变探针；（6）有时泳道中不仅会加入蛋白与WT探针，还会额外加入能够结合蛋白的抗体，由于迁移速率进一步被影响，会在常规迁移条带上方再出现另一条迁移条带，称为“超迁移”。05EMSA实验注意事项（1） 核酸酶污染所有试剂需用DEPC水配制，枪头/离心管选择无核酸酶型；蛋白提取时加入蛋白酶抑制剂，避免核酸酶残留。（2）操作手法“快准柔”结合反应后轻缓上样，避免剧烈震荡导致复合物解离；转膜时使用湿转法，电流控制在200 mA以内，防止过热。（3）及时整理数据化学发光法需在显影后2小时内拍照，避免信号衰减；注意检查凝胶凝固是否均匀、电泳温度是否过高。（4）试剂保存：探针避光存放，蛋白样品分装后冻存，缓冲液4℃短期保存，长期保存需-20℃且分装防止污染。（5）安全防护：进行放射性操作时，戴手套、护目镜，使用专用器具；丙烯酰胺是神经毒素，操作时戴手套，避免吸入粉末。EMSA作为分子生物学经典工具，持续为生命科学基础研究及转化应用提供关键证据链，是解析基因表达“开关”机制的利器，武汉金开瑞能够提供包括EMSA、双荧光素酶、酵母双杂等10余种分子互作技术服务，从方案流程设计到技术试验执行，从科研技术服务到成品试剂盒提供，金开瑞实验平台满足您的一切需求，期待与您一起携手合作。 来源：金开瑞生物
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