摘要：带有环境敏感型荧光团的荧光蛋白融合物已被广泛应用于研究蛋白质微环境的变化。然而，这些方法往往依赖于在目标蛋白的末端连接体积较大的荧光蛋白或标签，这可能会干扰目标蛋白本身的行为，并限制其在高空间分辨率下探测微环境变化的能力。

带有环境敏感型荧光团的荧光蛋白融合物已被广泛应用于研究蛋白质微环境的变化。然而，这些方法往往依赖于在目标蛋白的末端连接体积较大的荧光蛋白或标签，这可能会干扰目标蛋白本身的行为，并限制其在高空间分辨率下探测微环境变化的能力。

在本研究中，作者在目标蛋白的特定位点上遗传性地引入基于转子设计的荧光非天然氨基酸（ncAAs），通过其环境敏感的特性，实现对蛋白亚结构微环境变化的实时可视化。通过对氨酰-tRNA 合成酶（aaRS）进行计算机辅助重新设计，作者成功地在哺乳动物细胞中将这些环境敏感的荧光 ncAA 掺入了多种蛋白。通过将 ncAAs 精确地定位于蛋白的特定目标位点，研究者即可在蛋白发生聚集、聚簇、簇解离等过程中探测到该位点单个残基周围的微环境变化。

蛋白质或其结构域的微环境变化会引发伴侣蛋白结合、聚集或簇形成，这些过程与细胞调控及多种疾病密切相关。因此，监测这些微环境变化对疾病研究和治疗具有重要意义。现有的蛋白微环境检测手段难以在保证目标蛋白功能的情况下，于活细胞中连续监测目标蛋白内部区域的动态。因而亟需新方法实现高分辨率的微环境监测。

基于转子设计的荧光团（RBF）有对环境粘度敏感的特性：在低粘度下荧光淬灭，在高粘度下发光增强。若能将含有 RBF 的氨基酸探针定点安装在蛋白特定位点，就能实时追踪局部环境变化。遗传密码扩展（GCE）技术是一种将非天然氨基酸（ncAA）掺入蛋白特定位点的有效方法。此前，研究者们已利用GCE成功将一种荧光探针Anap掺入了蛋白中。然而Anap的工作波长较短，对不同溶剂与环境粘度的响应也较为微弱，这些因素使得Anap的实时荧光成像能力十分受限。

为解决以上问题，作者通过将Anap的共轭系统进行拓展，设计了一系列RBF-ncAA荧光探针。这些ncAA对环境的极性与粘度变化高度敏感（图1a）。其中，AnapTh已被证实具有最长的发射波长和最强的粘度敏感性。为了将AnapTh掺入目标蛋白以实时监测其微环境变化，作者使用计算方法对GCE方法的关键元件氨酰-tRNA合成酶（aaRS）进行了重新设计，获得的新变体AnapThRS可特异性地将AnapTh高效掺入目标蛋白的任一特定位点，且不具有细胞毒性（图1b）。

图1. （a）基于转子的ncAA的光物理表征和（b）用于AnapTh掺入的aaRS的计算设计

基于这一AnapTh掺入系统，作者首先对人超氧化物歧化酶（hSOD）和亨廷顿蛋白（Htt）的聚集进行了研究。hSOD 是保护细胞免受超氧自由基有毒产物侵害的重要酶，与家族性肌萎缩侧索硬化症有关；而Htt-polyQ肽段的聚集已被证明是亨廷顿病的原因。作者利用AnapTh在这两种目标蛋白特定位点的掺入实现了对它们聚集状态的实时监测，携带AnapTh的hSOD和Htt蛋白在聚集前后表现出了明显不同的荧光行为：蛋白在单体状态下荧光水平较低，经诱导聚集后则表现出高荧光信号（图2）。

图2. 使用AnapTh对（a）hSOD1和（b）Htt聚集过程中的微环境变化进行可视化

除了蛋白聚集，蛋白簇的活动也是细胞活动的重要调控过程。例如，基质相互作用分子1（STIM1）作为一种内质网驻留蛋白，在细胞钙稳态中起关键作用；隐色素2（CRY2）是广泛使用的光遗传学致动器，用于光控纵的蛋白质-蛋白质相互作用和各种亚细胞生化过程等。作者在保证目标蛋白正常行使功能的情况下，利用AnapTh的掺入，对活细胞中的STIM1和CRY2的簇形成过程进行了实时可视化追踪（图3）。

图3. 使用AnapTh对（a）STIM1和（b）CRY2簇聚集进行可视化追踪

总的来说，这种基于转子的荧光ncAA掺入系统将能够进行广泛的蛋白质研究。它能够以高分辨率的视角为蛋白质微环境变化与功能之间关系的研究提供新的见解，同时也帮助了研究者深入理解生物大分子在细胞中组装与发挥功能的过程。

这一成果近期发表在Nature Chemical Biology 上。论文的第一作者为莱斯大学（Rice University）杨舒丹博士、金石开博士和博士生张梦溪，陈昱达博士也为项目设计做出重要贡献。

Real-time imaging of protein microenvironment changes in cells with rotor-based fluorescent amino acids

Shudan Yang, Shikai Jin, Mengxi Zhang, Yuda Chen, Yiming Guo, Yu Hu, Peter G. Wolynes & Han Xiao

Nat. Chem. Biol., 2025, DOI: 10.1038/s41589-025-02003-1

Han Xiao现任莱斯大学 SynthX 中心主任，并担任化学系、生物科学系和生物工程系教授。课题组拥有崭新的实验室，一流的公共科研平台和良好的工作环境。课题组研究方向包括：生物探针、蛋白质化学修饰、蛋白进化、抗体偶联、化学生物学以及相关交叉学科。实验室现有多个位置开放，欢迎具有化学、生物化学、分子生物工程、化学工程、药学等相关专业背景的本科、硕士、及博士加盟。

来源：X一MOL资讯