PGA Biofelt植入级无纺布体外分离和培养人关节软骨细胞

摘要：在本研究中，我们旨在证明富含血小板的血浆释放物 (PRPr) 对接种在聚乙醇酸 (PGA) 3D 支架上的人类软骨细胞的分化特性。进行了基因表达和生化分析，以评估补充了 PRPr 的 PGA 软骨结构的质量改善。我们观察到，使用 PRPr 作为 PGA 软骨细

在本研究中，我们旨在证明富含血小板的血浆释放物 (PRPr) 对接种在聚乙醇酸 (PGA) 3D 支架上的人类软骨细胞的分化特性。进行了基因表达和生化分析，以评估补充了 PRPr 的 PGA 软骨结构的质量改善。我们观察到，使用 PRPr 作为 PGA 软骨细胞结构的细胞培养补充可能会促进软骨细胞分化，因此可能有助于比传统补充更长时间地维持软骨表型，因为它增加了重要的软骨标志物（例如 sox9、聚集蛋白聚糖和 II 型胶原蛋白），而不会诱导 I 型胶原蛋白。此外，我们还分析了我们的结构对重要 ECM 分子（sGAG、II 型胶原蛋白等）的分泌和沉积。我们的结果表明，PRPr 补充剂可能与基于 PGA 的支架协同作用，刺激人类关节软骨细胞分化、成熟和表型维持。 一、简介 关节软骨是一种无血管组织，具有有限的自我修复能力。最近提出的基于细胞的软骨修复程序要求从小活检中分离自体关节软骨细胞，在体外扩增，然后直接注射到缺损处或用于设计可植入移植物。一般来说，一些技术问题限制了这些技术的临床应用；特别是，(i) 从活检中获得的软骨细胞产量低，(ii) 在基于向培养基中添加胎牛血清 (FCS) 的传统培养系统中，软骨细胞在扩增阶段倾向于失去其软骨形成潜能，以及 (iii) 软骨细胞在扩增阶段后重新分化为软骨形成细胞的能力低。近年来，由于基于引入重组生长因子 (GF) 混合物的培养条件的发展以及使用支持体外和体内适当组织形成的各种生物相容性基质，这些方面中的许多方面得到了改善。然而，重组生长因子的一些缺点已经变得明显，例如保质期短和价格高。在之前的研究中，我们证明了人类 PRP 释放物 (PRPr) 补充剂在维持单维和三维 (3D) 人类软骨细胞培养物中软骨细胞样表型方面的高效性。本研究的目的是研究 PRPr 补充剂对基于聚乙醇酸 (PGA) 支架的软骨细胞构造的合成代谢特性。PGA 是一种合成聚合物，因其生物相容性和机械性能而成功用于软骨组织工程。为了评估与传统培养补充剂相比，PRPr 是否真的能有效改善基于 PGA 的软骨构造的质量，对不同培养补充剂后的软骨细胞 3D 培养物进行了基因表达分析和生化研究。结果表明，在 3D PGA-软骨细胞构建体中添加 PRP 可增强软骨细胞表型的维持，并改善透明软骨的生成。二、材料和方法2.1 富血小板血浆释放物的制备富血小板血浆释放物 (PRPr) 的制备由汇集的白膜层 (BC) 制备而成，对研究人员提出的方案进行了微小修改。将六名相同血型的健康志愿者的血液收集到 500 mL 袋中，其中含有柠檬酸-磷酸葡萄糖-腺嘌呤 (CPDA) 溶液作为抗凝剂 (1 mL CPDA/7 mL 血液)。每个血液单位在 3900g 下离心一次，每次 10 分钟，将全血分离成三个成分：血浆、红细胞和 BC 层。使用半自动提取系统 (Baxter Optilink)，将每个单位的血浆和红细胞转移到储存容器中，而红细胞则留在每个捐献袋中。然后将所有收集到的红细胞汇集在一起，第二天将其添加到从其中一名捐献者获得的等量血浆中。在轻柔旋转 (1100g，10 分钟) 后，将制剂进行白细胞过滤，以提供汇集的 PLT 浓缩物。然后通过两次冷冻 (分别为 −20℃ 和 −80℃) 和解冻 (37℃) 循环获得 PRPr，然后进行最后的离心步骤 (1500g，15 分钟，4℃) 以去除碎片。这种方法导致 PLT 膜破裂，导致血小板 α 颗粒中所含的 GF 大量释放到上清液中。然后通过添加葡萄糖酸钙对 PRPr 进行额外的凝固步骤，然后再次离心凝固的制剂（1500g，5 分钟），并收集剩余的上清液用作细胞培养补充剂。通过添加少量生理溶液将 PRPr 制剂的蛋白质浓度调整至 80 mg/mL，这与本研究中使用的 FCS 浓度相同。2.2 TGF-β1 定量按照制造商的说明，通过定量夹心酶免疫测定法（TGF-β1 检测试剂盒）测定血清和 PRPr 制剂中的 TGF-β1 水平。按照制造商的说明，通过定量夹心酶免疫测定法测定血清和 PRPr 制剂中的 PDGF-BB 和 PDGF-AB 水平。2.3 体外分离和培养人关节软骨细胞人关节软骨碎片取自三名骨关节炎 (OA) 患者的股骨头，这些患者根据美国风湿病学会 (ACR) 的临床和放射学标准进行定义，并接受了全髋关节置换术。手术后立即在无菌条件下将宏观健康的软骨切开并切碎成小块。碎片在含有 2% 青霉素/链霉素溶液和 0.2% 两性霉素 B (Sigma) 的杜氏改良 Eagle 培养基中洗涤。通过连续酶消化从关节软骨中分离软骨细胞：在洗涤液中 37℃ 下用 0.1% 透明质酸酶 (Sigma) 消化 30 分钟，用 0.5% 链霉蛋白酶 (Sigma) 消化 1 小时，用 0.2% 胶原酶 (Sigma) 消化 1 小时。然后用 70 mm 尼龙网过滤细胞悬浮液两次，洗涤并在 700g 下离心 10 分钟。然后将细胞沉淀物重新悬浮在含有 10% FCS 的 DMEM 中并接种在单层培养中。来自各个供体的细胞分别在 37℃、95% 相对湿度和 5% CO2 气氛下培养。然后用胰蛋白酶/EDTA 溶液分离处于亚汇合条件下的软骨细胞，并在培养皿中扩增，再传代三次，起始密度为 1×10^5 细胞/cm²。在将细胞培养物接种到 3D 支架上之前，先进行 3 天的血清饥饿处理。2.4 PGA 支架接种将干 PGA 支架（1 cm² 表面，2 mm 厚度，70 mg/cc 密度，BIOFELT，Synthecon）接种到不同的胰蛋白酶分离软骨细胞悬浮液中（150 μL 培养基中 2×10^6 个细胞，补充有 5% PRPr 或 5% FCS），然后将其放入 CO2 培养箱中 3 小时，使用抗粘附 24 孔板，以避免细胞迁移到板底。然后将细胞培养物分别在补充有 5% PRPr 或 5% FCS 的 DMEM 中培养 10 或 20 天。每周更换两次培养基。

东莞市富临塑胶原料有限公司是 PGA Biofelt植入级无纺布的专家，富临塑胶为客户提供“服务”和“PGA Biofelt无纺布”。2.5 基因表达分析通过实时 PCR (RT-qPCR) 检测评估与软骨细胞分化相关的特定基因的转录表达。在培养的第 10 天和第 20 天分别收集每个培养构建体，将其转移到 500 mL RNA 保护细胞试剂 (Qiagen) 中并储存在 −80℃ 下。使用 RNeasy Plus minikit (Qiagen) 提取总 RNA，并使用 QuantiTect 逆转录试剂盒 (Qiagen) 从 200 ng RNA 中获得 cDNA。然后使用 LightCycler 仪器 (Roche) 和 QuantiFast SYBR Green PCR 试剂盒 (Qiagen) 进行实时 PCR 分析。靶基因[人I型胶原蛋白（Col1A1）、人II型胶原蛋白（Col2A1）、sox9、聚集蛋白聚糖（Agg）]和参考基因[3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）]使用来自TibBiol Mol（Roche）的特定引物对进行扩增，如Spreafico报道的。对于每个样品，通过熔解曲线分析测试PCR产物的质量，并通过琼脂糖凝胶电泳确认产物的大小。根据制造商的说明，使用LightCycler软件版本3.5提供的Fit Point方法对原始荧光数据进行分析。使用Livak方法（2-Ct）进行定量分析。2.6 生化分析在培养的第10天和第20天收获补充有5％PRP或5％FCS的不同构建体，以进行sGAG和DNA定量。将细胞聚合物构建体冷冻干燥，并在 60℃ 下用 500 μL 木瓜蛋白酶溶液（0.56 U/mL 木瓜蛋白酶溶解在 50 mM 磷酸盐缓冲液、1 M NaCl、5 mM 半胱氨酸-HCl、1 mM EDTA，pH 6.8 中）消化过夜。使用 Blyscan 硫酸化糖胺聚糖测定法，通过与 1,9-二甲基亚甲蓝反应，测定每个木瓜蛋白酶处理的培养物中的总硫酸化 GAG 含量。将结果标准化为每个测定培养物的相关 DNA 含量。使用 QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen）提取 DNA，并使用高灵敏度 Qubit 定量系统进行测量。2.7 组织学和免疫荧光分析通过组织学检查（通过甲苯胺蓝染色）评估 PG 积累情况，并通过免疫荧光检查 II 型胶原沉积情况，评估 3D 培养物中软骨基质成分的沉积情况。在第 10 天和第 20 天，在 PGA 支架上生长的软骨细胞嵌入“TissueTec” 中，并在液氮中冷冻。用冷冻切片机切割厚度为 7-15 μm 的切片。然后用 4% 甲醛固定冷冻切片 20 分钟，清洗并用甲苯胺蓝染色，通过光学显微镜观察细胞形态和 PG 分布。为了检测胶原蛋白 II 型沉积，将固定切片冲洗，用 1% BSA/PBS 孵育，然后在加湿的空气中在室温下再次用小鼠抗胶原蛋白 II 型单克隆抗体 (Sigma) 孵育 60 分钟。在结合一抗后，将样品在 1% BSA/PBS 中清洗，然后在室温下用荧光标记的山羊抗鼠二抗 (Invitrogen) 孵育 45 分钟。最后，将冷冻切片嵌入封固剂中，并用 Leica DM/LB 荧光显微镜系统观察。2.8 统计分析数据以平均值±标准表示。通过单因素方差分析 (ANOVA) 和 Student 事后 t 检验评估组间数据的差异。p 值本研究已获得当地大学医院伦理委员会的批准，并获得了所有患者（人关节软骨碎片）和健康志愿者（血液样本）的知情同意。三、结果3.1 血小板释放物我们的浓缩方案使 PRPr 级分的 PLT 量与全血相比增加了 5.76 倍（分别为 1586.3±127.2×10^3 /μL 和 275.8±24.7×103 /μL）。类似地，与来自相同血液的血清相比，PRPr 中的 TGF-1β、PDGF-AB 和 PDGF-BB 水平明显更高（分别为 3.66、8.01 和 6.41 倍）（TGF-1β：119.8±18.7 ng/mL vs 32.7±5.2 ng/mL；PDGF-AB：48.31±1.13 ng/mL vs 6.03±0.37 ng/mL；PDGF-BB：29.27±1.72 ng/mL vs 4.56±0.62 ng/mL）。3.2 软骨标志物的基因表达为了评估与 FCS 相比，PRPr 补充剂是否能够增强制备的构建体的软骨特性，我们评估了与软骨分化相关的特殊生物标志物的 mRNA 表达（图 1）。在这些实验中，单层培养中生长的软骨细胞被用作去分化生化和功能状态的参考。

图 1. 在 5% FCS 或 5% PRPr 存在下，在 PGA 支架上接种并培养 10 和 20 天的人类软骨细胞中 Sox9、II 型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖和 I 型胶原蛋白的随时间变化基因表达。数据被标准化为 GADPH mRNA 水平，并使用单层中第一次传代的人类软骨细胞培养物作为对照（倍数变化）。结果显示为 3 个独立实验培养的基因表达倍数变化 ± S.D.。*p转录因子 sox9 的表达在前 10 天内上调，与所应用的不同培养处理无关（与去分化单层软骨细胞培养相比，FCS 处理的构建体上调 6.0 倍，PRPr 处理的构建体上调 5.1 倍，p在前 10 天内，在 PGA 中生长的所有培养物中，Aggrecan 基因表达似乎暂时降低（与去分化单层软骨细胞培养物相比，FCS 处理的培养物减少 0.6 倍，PRPr 处理的培养物减少 0.45 倍，p3.3 糖胺聚糖积累和 DNA 含量测量分别与 FCS 或 PRPr 一起培养并在 10 天或 20 天后收获的细胞聚合物构建体中的 sGAG 含量，结果与之前描述的基因表达分析一致。20 天后，所有培养构建体中的 sGAG 积累显著增加：FCS 处理的构建体从 5.15±0.58 μg GAGs/ μg 总 DNA 增加到 16.97±1.02 μg GAGs/ μg 总 DNA，PRPr 处理的构建体从 3.66±0.27 μg GAGs/ μg 总 DNA 增加到 22.66±1.36 μg GAGs/ μg 总 DNA（图 2）。此外，与用 FCS 培养的构建体相比，用 PRPr 培养的构建体的 sGAG 增加了 33%。

图 2. 在补充有 5% FCS 或 5% PRPr 10 或 20 天的 PGA 结构中 GAG 的积累。结果显示为平均值 ± S.E。3 个独立实验培养。*p3.4 组织学和免疫荧光分析为了研究不同构建体中合成的细胞外基质的质量和丰度，我们进行了组织化学和免疫荧光分析。甲苯胺蓝染色显示，培养 20 天后，用不同补充剂处理的构建体之间存在差异（图 3）。特别是，经 PRPr 处理的培养物呈现为圆形细胞簇，周围环绕着丰富、均匀、富含 PG 的异染性细胞外基质（图 3 中的白色箭头）。

图 3. 组织学染色。通过甲苯胺蓝染色评估培养 20 天的 PGA 构建体中 PG 的积累，培养 20 天的 PGA 构建体中 5% FCS（左）和 5% PRPr（右）作为不同的培养补充剂。比例尺：50 μm。免疫荧光分析证实了补充 PRPr 后 II 型胶原蛋白合成的增强。如图 4 所示，培养 20 天后，经 PRPr 处理的培养物显示出强烈且弥散的细胞外基质染色，尤其是在细胞周围区室中（图 4 中的白色箭头）。相反，在用 FCS 生长的培养物中观察到生物聚合物纤维之间的荧光较弱且弥散性较差。

图 4. 免疫荧光显微镜。培养 20 天的 PGA 构建体中胶原蛋白 II 型的免疫定位，培养 20 天的 PGA 构建体中 5% FCS（左）和 5% PRPr（右）作为不同的培养补充剂。比例尺：50 μm。四、讨论目前，自体软骨细胞移植（ACT）是治疗软骨物质损失（经常演变为骨关节炎或运动损伤）的一种有价值的替代方法。尽管细胞培养技术取得了相关进展，但基于细胞的软骨修复程序仍需要进一步改进，以克服其局限性：软骨细胞在体外单层扩增过程中去分化、健康软骨细胞数量少且增殖率低、ECM 产量低、软骨细胞成熟向终末分化加速。再生医学和软骨组织工程特别关注刺激细胞增殖、稳定软骨表型以及延缓细胞向终末肥大进展。最近，人们提出了各种干预策略，包括使用特定 GF（如血小板衍生物）进行治疗，以及使用由天然化合物（如胶原蛋白或透明质酸）和/或生物相容性合成聚合物组成的 3D 基质或支架，这些材料能够模拟体内软骨环境。本研究的目的是扩展我们对血小板提取物分化特性的认识，特别是 PRPr，用作基于 PGA 3D 支架的软骨结构最佳体外制备的补充剂。与基于 FCS 的标准培养系统相比，评估了 PRPr 补充剂的效果，因为正如我们和其他作者已经证明的那样，FCS 和人血清补充剂表现出相似的软骨分化能力。PRPr 可以成为自体和高度浓缩的生长和分化因子的经济且有价值的来源，其在临床实践以及软骨组织工程中的应用已被广泛记录。具体而言，在之前的一项研究中，我们报告了通过优化和标准化方案获得的 PRP 释放物在人类关节软骨细胞单层培养中维持软骨细胞样表型的功效。PGA 是一种经 FDA 批准的合成聚合物，由于其生物相容性和更高的降解率而常用于软骨组织工程。多项研究已经证明了 PGA 支架在重新分化因体外扩增而发生去分化的软骨细胞方面的可靠性，以及修复体内关节软骨缺损。在我们的研究中，所应用的 PRPr 浓度不具有细胞毒性，并且以浓度依赖性方式增加人类软骨细胞活力（未显示数据）。与之前对 PGA/软骨细胞结构进行的研究一致，我们观察到 PGA 能够诱导先前在单层中传代的接种软骨细胞发生明显的再分化。此外，我们观察到，作为细胞培养补充剂，PGA 支架和 PRPr 的联合使用似乎不仅显著促进了软骨细胞分化，而且通过进一步增加 sox9 和 II 型胶原蛋白的高水平，同时限制 I 型胶原蛋白的合成，比传统补充剂更长时间地维持软骨表型。事实上，在补充 FCS 20 天后观察到的软骨标志物下降表明，单独的 3D 支架在维持长期软骨分化方面效果较差。这种行为的可能原因在于 FCS 和 PRPr 补充剂之间生长因子和信号蛋白的含量不同。PRPr 是一种非常宝贵且廉价的生长因子来源。其中，PDGF 同工型已被证实可上调软骨细胞增殖和 ECM 生成，而 TGF-β 被认为通过诱导 sox9 上调与维持非肥大性软骨细胞表型密切相关。事实上，在整个实验过程中，在我们的细胞模型（5% PRPr）中，TGF-β 的浓度与软骨细胞分化研究所需的浓度（5 ng/mL）一致，几乎比对照培养物（5% FCS）高 5 倍。转录因子 sox9 通过启动软骨形成在软骨发育中起着关键作用，并且 sox9 转录的增加已被证明与软骨细胞分化过程有关。此外，sox9 过度表达可能会延迟随后的成熟过程，通过抑制 Runx2 转录因子（肥大性软骨细胞分化的主要激活剂）导致软骨细胞肥大。在我们的实验中，我们推测 PRPr 诱导的 sox9 水平的大幅短暂增加可能同时刺激软骨形成活性并防止 ACT 培养期间的肥大。软骨组织工程的主要努力之一是寻找一种旨在生产适当功能性透明软骨的方法，通过促进 II 型胶原蛋白的表达，同时在中期和长期限制 I 型胶原蛋白的表达。关于这一点，我们在构建体中观察到的 I 型和 II 型胶原蛋白分子的表达模式强烈支持了我们方法的可靠性。在表型标记检查中，值得注意的是，在 PRPr 存在下培养 20 天后，尽管 sox9 表达适度增加，但 II 型胶原蛋白表达显著增加。这种现象可能是软骨成熟前 sox9 mRNA 水平饱和的结果，正如研究人员所建议的那样，他们结合 PRPr 的抗炎和再生潜力以及使用 3D 支架可以抵消 II 型胶原蛋白的降解。我们进一步研究了 PRPr 对我们的构建体分泌和沉积 ECM 分子（如 II 型胶原蛋白和蛋白聚糖）的影响。研究人员在分化过程中，这些分子提供了一个保留软骨细胞表型的环境。证明，PGA 诱导的 sGAG 每细胞积累量最大，并且 sGAG 释放到培养基中的速率最高。在我们的研究中，经过 20 天的治疗后，PRPr 补充显著提高了培养基中 sGAG 的水平。此外，用甲苯胺蓝对蛋白聚糖进行组织学染色以及对软骨特异性 II 型胶原进行免疫荧光染色表明，在体外培养 20 天后，补充了 5% PRPr 的 PGA 构建体与补充了 5% FCS 的 PGA 构建体相比，构建体中基本 ECM 分子的沉积更高，分布更均匀。这些结果证实，我们的构建体能够诱导透明样细胞外基质的形成，该基质可能具有原始基质的生理特性。总之，我们对基于 PGA 的软骨结构进行的时间顺序分析表明，PRPr 补充剂可能通过增强几种软骨标志物的表达以及软骨基质成分的合成和沉积来促进细胞成熟和表型维持。此外，由于 PRPr 对炎症级联的抑制作用和较差的免疫原性，人们推测它可用于治疗多种自身免疫性疾病患者，并且已经通过向类风湿关节炎的猪动物模型施用 PRP 获得了令人鼓舞的结果。尽管如此，在自身免疫病例中联合使用 PRPr 和 PGA 支架应仔细评估，以避免病情恶化或影响移植物寿命的潜在严重不良反应。虽然我们的工作仅提供了初步的体外数据，但据我们所知，这是第一项在分子水平上显示 PRPr 补充剂和 PGA 支架之间存在潜在协同作用的研究。此外，我们的研究结果与研究人员进行的临床研究完全一致，有力地支持了在临床实践中PRPr与PGA支架的联合使用。