摘要：肝细胞癌（HCC）是全球癌症患者死亡的常见原因。最新研究发现，药物诱导脂毒性为HCC治疗带来新方向。合成的LXRα激动剂可让肿瘤细胞产生有毒饱和脂肪酸，与“DFG-out”型Raf抑制剂联合使用时，后者阻断脂肪酸去饱和过程，二者协同激活LXRα，引发癌细胞脂毒

肝细胞癌（HCC）是全球癌症患者死亡的常见原因。最新研究发现，药物诱导脂毒性为HCC治疗带来新方向。合成的LXRα激动剂可让肿瘤细胞产生有毒饱和脂肪酸，与“DFG-out”型Raf抑制剂联合使用时，后者阻断脂肪酸去饱和过程，二者协同激活LXRα，引发癌细胞脂毒性死亡。但由于缺少临床适用的特异性LXRα激动剂，这一疗法目前无法用于临床。为此，德国图宾根大学研究团队开发出一系列马来酰亚胺类LXR激动剂，提升了对LXRα的作用强度和特异性。其中，先导化合物40对LXRα选择性优异，在肝细胞癌类器官实验中疗效显著，为推动脂毒性治疗策略的临床应用带来希望。

药渡CyberSAR系统提供了对LXRα激动剂分子的深入解析。系统通过聚类结构视图和原始结构视图，展示了与靶点相关的活性分子，并以研发阶段时光轴的形式呈现了潜力Hit。帮助研发人员快速获取靶向结构信息，开拓研究思路。尽管CyberSAR在本案例分子的初步开发中未被使用，但其在解析和优化药物分子方面显示出巨大的应用潜力。

研究背景

原发性肝癌主要由肝细胞癌（HCC，占比约90%）和肝内胆管癌（iCCA）组成，是全球第三大癌症致死病因。2022年肝癌发病超80万例，随着NASH等致癌肝病增加，发病率还将持续上升。肝细胞癌对传统细胞毒性疗法、靶向疗法耐药性强，免疫疗法也仅对部分患者有效，特别是NASH相关的肝细胞癌，大多难以通过免疫检查点抑制剂治疗。

最新研究提出，药物诱导脂毒性为HCC治疗带来新方向。该疗法通过LXRα合成激动剂激活肿瘤细胞内脂肪酸从头合成，同时抑制Raf-1激酶阻断脂肪酸去饱和，使饱和脂肪酸在细胞内蓄积，引发脂毒性、氧化应激和内质网应激，最终促使癌细胞凋亡。机制上，Raf-1可直接结合SCD1并增强其稳定性，而DFG-out型Raf抑制剂能阻断这一过程、降低SCD1活性，联合T0901317、GW3965等LXR激动剂，可实现饱和脂肪酸的毒性积累。

“诱导脂毒性”疗法在HCC动物和人体模型中克服耐药性，小鼠耐受性良好，具有临床应用潜力，但特异性LXRα激动剂尚未应用于临床，开发此类配体是推进该疗法临床转化的关键。

核受体（NRs）通过内源性配体激活调控细胞活动，LXR的α和β异构体与RXRs结合，调节脂肪酸和胆固醇代谢。配体结合可改变LXR构象，调控转录过程。因核受体在转录调控中的重要性，LXR激活被用于多种疾病治疗，虽已开发多种激动剂且部分通过I期临床试验，但因LXRα和β配体结合口袋相似，现有激动剂难以特异性激活LXRα，不适用于脂毒性癌症治疗。

研究团队为开发适用于脂毒性癌症治疗的LXRα激动剂，分析了GSK3987和AZ876两种配体。前者的马来酰亚胺核心结构可产生促进核受体激活的相互作用；后者对LXRα活性更高，其脂肪生成与特定靶标相互作用相关。最终，基于对LXR异构体选择性和脂肪生成关系的研究，成功设计出对LXRα选择性显著提高的激动剂，与“DFG-out”型Raf抑制剂联用在HCC细胞和肝癌类器官培养中展现出良好治疗效果。

结果与讨论

分子设计

研究以马来酰亚胺核心为分子设计和构效关系研究起点，因其与LXR存在相互作用。通过对R1和R2取代基进行逐步改造，目标是增强激动剂效力，明确影响α选择性的相互作用因素。

在分子设计与构效关系研究中，研究人员以马来酰亚胺核心为基础，从三个方面对化合物进行改造。其一，改变R1结构，同时保留化合物3中R2的对甲氧基及马来酰亚胺核心3号位的苯基，通过探究R1不同的空间位阻和电子性质，寻找提升化合物性能的方向；其二，针对R2与马来酰亚胺核心之间的N-H键进行修饰，制备含醚键连接和芳环直接相连（无连接基团）的两类化合物，旨在明确该键与Phe263主链形成氢键的重要性；其三，通过改变R2取代基，探索配体结合口袋深度及与H1、H2螺旋氨基酸残基的潜在新作用。通过对比GSK3987（3）和AZ876（4）的晶体结构发现，AZ876的N-苯基哌啶深入结合口袋，这种结构特征可能产生新的相互作用，从而增强对LXRα的选择性。

基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）分析的生化评估

在研究中，团队将R1作为结构修饰的起始位点，为探究构效关系，采用时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）分析方法，分别检测新合成化合物与LXRα和LXRβ异构体的结合及激活情况。通过在苄基环对位引入单点修饰，研究电子和空间位阻效应。实验测定了各化合物对两种异构体的半数有效浓度（EC50）值，并与GSK3987（3）对比，相关数据记录于表1。

研究人员围绕R1、R2及连接基团展开了一系列探索。在R1的研究中，以GSK3987（3）为基础，发现其虽有活性但无选择性。改变R1取代基时，吸电子基团-F（化合物16）使活性消失； -CH3（化合物17）稍提升β异构体活性， -CF3（化合物18）则完全失活；尝试更大的供电子基团（化合物19和20）也未能改善活性。更换R1环系结构，吡啶（化合物21）、环己基（化合物22）分别表现出微弱活性和显著失活，环丙烷（化合物23）有一定活性提升但偏好β异构体，叔丁基（化合物24）活性与对照相当但仍无选择性，未取代衍生物25则完全无活性，表明活性主要受疏水作用影响。

在改造R2之前，研究人员先聚焦于R2与马来酰亚胺核心的连接基团。合成的无连接基团（化合物27）、醚键连接（化合物26）及亚甲基延长（化合物28）的类似物均失去活性，这意味着NH基团酸性和连接基团柔性对活性至关重要，且结合口袋存在空间限制。后续研究将进入对R2进行修饰，以探究如何提升活性和选择性的新阶段。

研究人员对R2位置不同取代基的马来酰亚胺化合物展开测试。最初测试的带苯环的化合物29活性降低，带对氯苯环的化合物30几乎无活性；氟取代的化合物31活性微弱，引入甲基的化合物32对LXRα和LXRβ的EC50值高。含供电子羟基的化合物33活性稍有提升（LXRα和LXRβ的EC50分别为390 nM和206 nM），其变体化合物34活性更好（LXRα和LXRβ的EC50分别为278 nM和133 nM），二甲胺基化合物35活性优于对照物GSK3987（3）（LXRα和LXRβ的EC50分别为71 nM和91 nM），促使研究人员探索更大基团。

首次引入酰胺基的化合物36无活性，结构特殊的酰胺化合物37有显著活性但更倾向LXRβ（EC50 = 84 nM），含苯并二氧戊环的化合物38对LXRα和LXRβ活性相近（LXRα和LXRβ的EC50分别为42 nM和45 nM），3,5-二甲氧基取代的化合物39活性大幅下降。结果表明结合口袋可容纳大基团，且活性依赖特定相互作用。

研究人员对比GSK3987（3）和AZ876（4）结构及结合模式发现，二者部分结构占据同一结合口袋，由此尝试在苯环引入类似饱和环状取代基。其中，N-苯基哌啶取代的化合物40表现亮眼，对LXRα效力达42 nM，且对LXRα选择性比对LXRβ高6.3倍多（266 nM）；吗啉和硫代吗啉取代的化合物41和42虽对LXRα有活性（EC50分别为35 nM和50 nM），但因对LXRβ活性也提升（EC50分别为106 nM和123 nM），导致选择性降低。

在探索苯环末端脂环族基团时，苯哌嗪类似物43对LXRα活性大幅下降（EC50为1253 nM），却对LXRβ保留部分活性（EC50为283 nM）；甲基哌嗪类似物44无活性和选择性；Boc保护的化合物45因空间位阻失活；脱保护的4-氨基哌啶化合物46对LXRβ效力比对LXRα强5倍多（EC50分别为120 nM和630 nM），表明调节配体结合口袋深处氢键基团是实现选择性的关键。

后续对氨基哌啶和哌嗪残基的修饰中，调整氨基哌啶基团大小得到的化合物47和48更倾向作用于LXRβ；对哌嗪残基引入酰基的化合物49和50活性良好，化合物50对LXRα展现出高选择性。

R1与R2取代基组合

研究人员依据R1和R2取代基构效关系分析所得信息，设计并评估了一种马来酰亚胺类化合物51，其R2为N-苯基哌嗪，R1为叔丁基，是AZ876（4）的类似物。实验数据表明，化合物51对LXRα活性更高（36 nM），对LXRα的选择性是LXRβ的4倍（156 nM），证明马来酰亚胺是开发具有目标选择性LXR配体的可行骨架。作为概念验证，研究人员测试了R1无取代、R2为可增强活性的N-苯基哌啶的化合物52，该化合物对LXRα和LXRβ均无活性。

α与β选择性化合物的比较

通过FRET分析的剂量-反应曲线与统计数据可知，化合物40展现出对LXRα的高选择性。与其他化合物对比，GW3965（2）更易激活LXRβ，GSK3987（3）对LXRα和LXRβ的激活无明显偏好，而化合物40不仅对LXRα效力高，且激活LXRα与LXRβ的差异达6.3倍，显著高于AZ876（4）的5.2倍，凸显其在选择性上的优势。

研究发现，能激活LXRβ的化合物43、46-47都带有氢键供体基团。通过分子动力学模拟研究其作用机制发现，化合物40和46在LBD中的结合方式与GSK3987（3）类似，但它们的苯基哌啶残基和氨基-苯基哌嗪残基可深入H1/H2后口袋。进一步分析指出，化合物46形成的特定氢键相互作用，可能是其选择性作用于LXRβ异构体的关键因素。

新型LXRα激动剂的细胞活性分析

为探究新型LXRα激动剂40、46和51在HCC细胞中的活性，研究人员以人肝癌细胞系Hep3B为模型，构建了LXRα和LXRβ特异性报告基因检测系统。先借助CRISPR/Cas9技术分别敲除细胞中的LXRα基因NR1H3和LXRβ基因NR1H2，再利用慢病毒转移技术，将与GFP相连的LXRE稳定整合到细胞内，通过FACS分析GFP荧光强度，实现对两种LXR异构体胞内活性的单独测定。以GW3965（2）作为对照进行原理验证，结果显示其对LXRα和LXRβ的激活呈剂量依赖，且对LXRβ的激活活性显著高于LXRα（EC50 LXRα = 320 nM，EC50 LXRβ = 40 nM）。

为全面评估化合物活性，研究人员对GSK3987（3）、AZ876（4），以及新型马来酰亚胺化合物40、46和51进行测试。结果显示，除β选择性化合物46外，其余化合物均在HCC细胞中展现活性。其中，GSK3987（3）对LXRα和LXRβ激活作用中等（EC50 LXRα = 99 nM，EC50 LXRβ = 248 nM）；AZ876（4）可强烈激活LXRα（EC50 LXRα = 3 nM，EC50 LXRβ = 35 nM），其类似物化合物51也能激活LXRα；化合物40表现尤为突出，对LXRα激活能力强，且激活LXRα和LXRβ的差异显著，LXRα的EC50（27 nM）比LXRβ（631 nM）低超23倍。

此外，为验证化合物40的特异性（以化合物46为对照），研究人员在饱和浓度（10 μM）下，通过细胞报告基因检测其对8种关键核受体（涉及肝脏代谢调节和药物代谢）的激活活性，结果表明化合物40对这些受体无明显激活作用。综上所述，化合物40能够在HCC细胞中特异性且高效地激活LXRα。

人肝癌细胞治疗实验

为探究化合物40在HCC细胞中的治疗功效，研究人员将其与“DFG-out”型Raf抑制剂索拉非尼（2 μM）联用，测试对Hep3B细胞活力的影响，并与GW3965（2）、GSK3987（3）和AZ876（4）进行对比。研究发现，2 μM索拉非尼单药治疗对Hep3B细胞疗效有限（补充图3），而GW3965（2）与索拉非尼联合使用可显著降低细胞活力，呈剂量依赖性（EC50 = 1.9 μM）。

研究对比了不同化合物的治疗效果。GSK3987（3）和AZ876（4）的治疗效果低于GW3965（2），而化合物40效果更优，与索拉非尼联用时降低Hep3B细胞活力的半数有效浓度EC50为1.7 μM（图6B-D）。单药实验发现化合物40单药治疗无明显效果（图6E）。

使用CellROX试剂检测发现，激动剂单药不显著诱导氧化应激，但与索拉非尼联用时，所有测试化合物都增加氧化应激，且化合物40诱导氧化应激的能力强于GW3965（2）、GSK3987（3）和AZ876（4）（图6F、G）。

分析氧化应激反应因子超氧化物歧化酶1（SOD1）和内质网应激反应因子GADD34、CHOP（GADD153）的活性，发现其激活与激动剂有关，化合物40与索拉非尼联用强烈诱导这些因子激活（图6H）。

用单不饱和脂肪酸盐油酸钠补充Hep3B细胞后，大量单不饱和脂肪酸显著削弱了化合物40与索拉非尼联合治疗的效果（图6I）。

综上，化合物40与Raf抑制剂联用在肝癌细胞中具有强脂毒性和良好的治疗效果。

分析新型LXRα激动剂在未转化细胞和肝癌类器官中的治疗效果

为探究化合物40的治疗潜力，研究分析了它与脂毒性疗法联用在未转化肝细胞中的效果。采用已有的未转化肝细胞系AML12和BNL CL.2，对其进行化合物40与索拉非尼联合处理。结果显示，未转化肝细胞与Hep3B细胞不同，对该联合疗法敏感性极低（图7A），表明此疗法存在明显的治疗窗。

最后，研究人员在三维肝癌类器官培养的临床前治疗研究中分析化合物40的疗效。从鼠肝肿瘤中分离出由肉豆蔻酰化Akt1和过表达Myc驱动的肝癌类器官，对其进行索拉非尼单药、化合物40单药及两者联合治疗（图7C），并将治疗结果与含已确定激动剂T0901317（1）和GW3965（2）的联合疗法对比。两种已确定的LXR激动剂与索拉非尼联合时呈剂量依赖反应，且GW3965（2）疗效高于T0901317，但化合物40与索拉非尼联合的治疗效果更优（图7B）。总体而言，数据表明化合物40在肝癌治疗方面治疗潜力强大，且证实了使用LXRα激动剂诱导药理学脂毒性这一策略的有效性。

总结

本研究聚焦新型马来酰亚胺衍生物，完成从设计、合成到活性评估的全流程研究，成功开发出用于脂毒性癌症治疗的高效LXRα选择性激动剂。借助TR-FRET技术解析构效关系，经多轮结构修饰明确影响活性与选择性的关键结构特征。

研究确定化合物40和51选择性激活LXRα，化合物46偏好LXRβ，分子动力学研究证实H1/H2口袋后部相互作用对选择性的重要性。在Hep3B细胞实验中，化合物40展现出最高的LXRα/β选择性，且对8种相关核受体无交叉激活。与索拉非尼联用时，化合物40在肝癌细胞中显著增强治疗效果，提升氧化应激和内质网应激诱导能力；在肝癌类器官模型中疗效进一步优化，同时对正常肝细胞毒性较低。

该研究成果证实了脂毒性癌症治疗策略的可行性，凸显LXRα选择性激动剂优势，明确异构体选择性的关键作用机制，筛选出高活性化合物。先导化合物40的优异表现为后续肝癌临床治疗药物开发提供了重要参考和坚实基础。

文献来源
10.1021/acs.jmedchem.4c02712

来源：药渡数据库