摘要：跨膜蛋白因其在细胞信号传导、物质转运和免疫识别等生物学过程中扮演关键角色，成为生物医药和结构生物学研究的重要目标。然而，由于其复杂的结构和特殊的生物学特性，跨膜蛋白的表达和纯化常常面临诸多挑战。大肠杆菌（Escherichia coli）作为一种高效、经济的表

跨膜蛋白因其在细胞信号传导、物质转运和免疫识别等生物学过程中扮演关键角色，成为生物医药和结构生物学研究的重要目标。然而，由于其复杂的结构和特殊的生物学特性，跨膜蛋白的表达和纯化常常面临诸多挑战。大肠杆菌（Escherichia coli）作为一种高效、经济的表达系统，在跨膜蛋白的研究中具有重要应用价值。

一、跨膜蛋白表达的挑战与大肠杆菌系统的优势

跨膜蛋白通常具有多个跨膜螺旋结构，其疏水性和空间结构使其在大肠杆菌细胞质中容易形成包涵体，导致表达量低和功能丧失。相比之下，大肠杆菌系统具有以下优势：

高效表达：大肠杆菌具有快速的生长速度和高效的转录、翻译机制。

成本低廉：培养成本低，适合大规模生产。

操作简便：成熟的分子生物学技术和丰富的表达载体系统，支持多种策略优化跨膜蛋白表达。

二、跨膜蛋白表达优化策略

1. 选择合适的表达载体和宿主菌株

表达载体设计：强启动子（如T7、lacUV5）可提高转录水平；多克隆位点的灵活性有助于融合标签的添加。融合标签（His、GST、MBP等）不仅便于纯化，也能增加蛋白溶解性。

宿主菌株选择：BL21(DE3)是最常用的高表达菌株；Rosetta提供罕用tRNA，提高外源基因表达效率；C41和C43适合毒性蛋白或难折叠蛋白的表达。

2. 优化培养条件

诱导剂浓度和时间：低浓度IPTG（0.05–0.2 mM）诱导可降低蛋白过度表达导致的细胞压力，同时提高折叠正确的蛋白比例。

温度调控：16–20℃低温诱导有助于减少包涵体，促进跨膜蛋白在膜上的正确定位。

培养基成分：添加甘油或葡萄糖等碳源，提供缓慢、稳定的能量供给，降低应激反应。

3. 跨膜蛋白的折叠和定位

信号肽的使用：在目标蛋白N端添加PelB、OmpA等信号肽，将蛋白导向细胞膜或周质空间，有助于正确折叠。

分子伴侣和辅助因子：表达GroEL/GroES、DnaK/DnaJ等分子伴侣，显著提高复杂跨膜蛋白的溶解性和功能性。

4. 包含体的处理与重折叠

包涵体分离：通过高速离心提取包涵体，利用洗涤去除非特异性杂质。

重折叠方法：通过逐步稀释或梯度透析，将蛋白从去污剂或尿素缓冲液中缓慢恢复活性，形成功能性蛋白。

5. 跨膜蛋白的纯化策略

去污剂提取：使用如DDM、OG等温和去污剂提取膜蛋白，保持结构稳定。

亲和层析纯化：His标签、GST标签或Strep标签便于快速纯化并保证蛋白质量。

去污剂去除和缓冲优化：透析和稳定剂组合可恢复蛋白的天然构象，保证下游功能研究可行性。

三、案例分析

案例一：G蛋白偶联受体（GPCR）

GPCR是典型的多跨膜蛋白，传统表达系统中往往难以获得可溶性蛋白。研究表明，将GPCR基因克隆至pET系列载体中，在BL21(DE3)菌株中低温诱导表达，同时在N端添加MBP融合标签，可以显著提高蛋白溶解性。通过DDM去污剂提取后结合Ni-NTA亲和层析，获得高纯度的功能性GPCR，用于后续配体结合实验和晶体学研究。

案例二：钙通道跨膜蛋白（Ca²⁺通道）

钙通道蛋白表达量低且容易形成包涵体。研究团队采用C43(DE3)菌株，并辅以GroEL/GroES分子伴侣协同表达，通过16℃低温诱导和IPTG梯度调控，实现了蛋白部分定位于膜上。经过去污剂提取和His标签亲和层析，获得了活性蛋白，成功进行电生理功能验证。

案例三：ABC转运蛋白

ABC转运蛋白结构复杂且多为多跨膜螺旋，传统表达中包涵体比例高。通过在N端添加OmpA信号肽，导入周质空间，并在培养基中添加低浓度甘油缓冲细胞应激，蛋白定位在内膜上。结合DDM去污剂提取和梯度洗脱的Ni-NTA纯化策略，最终获得可用于ATP酶活性检测和晶体学分析的蛋白样品。

案例四：人源肾上腺素受体（β2-AR）

β2-AR在大肠杆菌表达时常因疏水性强而形成包涵体。研究显示，通过融合MBP标签、降低诱导温度至18℃、并使用Rosetta(DE3)菌株提供稀有tRNA，可以增加溶解性。结合GDN去污剂提取和Strep-Tactin层析纯化后，获得的蛋白在配体结合实验中表现出天然活性。

案例五：溶菌酶相关跨膜蛋白（Lysozyme-related TM protein）

此类小型跨膜蛋白在大肠杆菌中表达困难。采用PelB信号肽导向周质空间，并辅以GroEL协助折叠，低温诱导表达后进行包涵体重折叠，结合His标签纯化策略，成功获得功能性蛋白用于抗菌活性研究。

来源：积极的辰小创