摘要：在婴儿配方奶粉和功能性食品领域，母乳中的关键成分 2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL）能够促进婴儿肠道健康和调节免疫功能，因此备受关注。然而，传统化学合成法步骤繁琐，微生物合成虽具潜力，但常用的大肠杆菌体系存在内毒素风险，消费者接受度低。
在婴儿配方奶粉和功能性食品领域，母乳中的关键成分 2′-岩藻糖基乳糖（2′-FL）能够促进婴儿肠道健康和调节免疫功能，因此备受关注。然而，传统化学合成法步骤繁琐，微生物合成虽具潜力，但常用的大肠杆菌体系存在内毒素风险，消费者接受度低。
近日，西北农林科技大学赵晨、浙江大学方浩等合作通过代谢工程改造安全级微生物毕赤酵母，成功实现了 2′-FL 的高效从头合成，在 3 L 发酵罐中产量达到 22.35 g/L，刷新了该酵母合成此类化合物的纪录，相关成果以题为“Engineering Pichia pastoris for Efficient De Novo Synthesis of 2′-Fucosyllactose”发表在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 期刊。
研究团队首先面对的挑战是如何在毕赤酵母中搭建 2′-FL 的合成路径。这种由乳糖与岩藻糖通过 α-1,2 糖苷键连接而成的寡糖，需要多个异源酶的协同作用。借助 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术，团队将来自不同微生物的五个关键基因精准整合至酵母基因组：乳糖转运蛋白 Lac12 负责原料输入，大肠杆菌的 Gmd 和 WcaG 催化岩藻糖前体合成，幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶 FucT2 完成糖苷键连接，而粗糙脉孢菌的转运蛋白 Cdt-2 则将产物分泌至胞外。经过启动子优化与基因定位，摇瓶发酵中 72h 的初始生产滴度为 1.01 g/L，为后续优化奠定了基础。
图 | 基于 CRISPR-Cas9 的基因编辑技术构建毕赤酵母中 2′-FL 从头生物合成途径
然而，关键酶 FucT2 的活性不足成为瓶颈。该酶在酵母中易形成不溶性聚集体，且对乳糖的催化效率低下。研究团队创新性地采用蛋白标签融合策略，在 FucT2 的 N 端添加 SUMO 或 Ub 标签，显著提升其可溶性与稳定性，使产量提高至 1.27 g/L。
图 | 展示了岩藻糖基转移酶 FucT2 的结构预测、关键突变位点筛选及多轮突变优化过程，分子对接分析揭示了突变体与底物结合效率的提升
合成路径打通后，团队通过代谢流重塑，系统性优化了前体与辅因子的供应：过表达鸟苷酸激酶（gmk）和核苷二磷酸激酶（ndk）增强 GTP 供应，从而增加前体 GDP-L -岩藻糖，2′-FL 产量增加 10% 至 1.32 g/L；过表达参与戊糖磷酸途径和三羧酸循环的基因加速 NADPH 生成， 2′-FL 滴度提高到 1.55 g/L；加强参与 GDP-L-岩藻糖生物合成的关键基因（Pmi40/Sec53/Psa1）的表达，以提供足够的前体来提高 2′-FL 的产量， 2′-FL 的产量达到 1.72 g/L。
有趣的是，当团队尝试敲除丙酮酸脱羧酶基因（pdc1）以减少乙醇副产物时，却发现菌体生长严重受抑，2′-FL 产量骤降至 0.56 g/L。这一“意外”揭示了代谢调控需在“开源”与“节流”间精准平衡。
此外，团队通过 AlphaFold 2 预测来自幽门螺杆菌的 α-1,2-岩藻糖基转移酶（FucT2）的三维结构，结合 HotSpot Wizard 筛选活性中心关键位点，最终构建出四联突变体（T248S/Y255H/C279F/G178L），使 2′-FL 产量达到 2.55 g/L，较原始酶提升 50%。这一“半理性设计”策略不仅解决了催化效率问题，更为糖基转移酶的改造提供了新范式。
最终，工程菌株在 3 L 发酵罐中展现出惊人潜力。通过补料分批发酵策略，精准控制溶氧与 pH，菌体密度达到 395.5，较摇瓶提升 14 倍。持续补加乳糖与营养物后，2′-FL 产量最终定格在 22.35 g/L，较初始菌株提升 22 倍，且无副产物积累。这一数据不仅远超此前毕赤酵母的报道值 0.276 g/L，更接近大肠杆菌的工业化水平，而毕赤酵母的 GRAS 即公认安全特性使其在食品与医药领域更具优势。
这项研究的突破不仅在于产量提升，更在于验证了毕赤酵母作为复杂糖类合成底盘的可能性。未来，团队计划进一步优化发酵工艺并探索连续生产模式。随着合成生物学工具的升级，这种安全高效的细胞工厂或将成为母乳寡糖、药物糖基化产物等领域的核心平台，推动功能性食品与生物医药产业的革新。
参考链接：
1.Fang H, Gao J, Yu L, et al. Engineering Pichia pastoris for Efficient De Novo Synthesis of 2′-Fucosyllactose[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2025.
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来源：生辉SciPhi