Science Advances I 首次建立非洲猪瘟病毒感染性克隆平台

摘要：近日，美国 J.Craig Venter Institute（克雷格·文特尔研究所）Sanjay Vashee 研究员成果以“A synthetic genomics-based African swine fever virus engineering pl

近日，美国 J.Craig Venter Institute（克雷格·文特尔研究所）Sanjay Vashee 研究员成果以“A synthetic genomics-based African swine fever virus engineering platform（基于合成基因组学的非洲猪瘟病毒工程平台）”为题在 Science Advances（Q1 IF:11.7）发表。

非洲猪瘟（ASF）是家猪的一种致命性病毒性疾病，对全球养猪业有着巨大的经济影响。它存在于非洲、欧洲、亚洲以及加勒比海的伊斯帕尼奥拉岛。目前没有有效的治疗方法，也没有广泛获批许可的疫苗来预防这种疾病。由于缺乏方便的工具来对其病原体非洲猪瘟病毒（ASFV）进行基因改造，抗击非洲猪瘟的努力受到了阻碍，这在很大程度上是因为其庞大的非感染性基因组。本研究中作者报告了利用合成基因组学方法，借助一种由 CRISPR-Cas9 抑制的自辅助病毒，开发出一种针对非洲猪瘟病毒的反向遗传学系统，以便从合成基因组中重建有活性的重组非洲猪瘟病毒，从而快速产生各种非洲猪瘟病毒的组合突变体。该方法将极大地促进针对非洲猪瘟的治疗方法、亚单位疫苗和减毒活疫苗的开发。

作者基于之前的研究提出了一个假设：一种其复制能被某种机制（如宿主细胞中的 Cas9 切割）有效抑制的非洲猪瘟病毒株，应该可以作为一种自辅助病毒，用于包装或 “启动” 对该抑制机制具有抗性的非洲猪瘟病毒株的病毒粒子 DNA，从而实现病毒的重建。这个想法类似于 20 世纪 60 年代和 70 年代初期使用条件致死的 “辅助” 噬菌体来转染分离出的野生型 DNA 的方法。

因此，为了验证这一假设，作者选择了两株重组非洲猪瘟病毒株，ASFV-ArmeniaΔ285L::GFPhuCD4 和 ASFV-NHVΔTK::GFP，这两株病毒都表达绿色荧光蛋白（GFP），并且会因 p30 基因被 Cas9 切割而受到抑制，将它们作为自辅助病毒，同时选择 ΔCD2v::DsRed 作为用于病毒重建的供体基因组。在将 ΔCD2v::DsRed 基因组转染到正常的 WSL 细胞中，随后用 ASFV-ArmeniaΔ285L::GFPhuCD4 或 ASFV-NHVΔTK::GFP 感染后，观察到的主要是发绿色荧光的病灶，只有少数发红色荧光或双荧光的病灶。

作者使用空斑大小和在 WSL 细胞上的生长动力学测定对重建的 ΔCD2v::DsRed (D) 进行了表征。正如预期的那样，它表现出与亲本 ΔCD2v::DsRed (V) 相似的空斑大小。此外，ΔCD2v::DsRed (D) 的复制动力学与亲本 ΔCD2v::DsRed (V) 几乎相同。这些结果验证了作者的假设，即自辅助病毒可用于从转染的非感染性基因组中重建病毒。

在成功开发出用于病毒重建的自辅助病毒启动方法后，作者随后建立了一个合成基因组学的基因组组装过程来组装非洲猪瘟病毒基因组，这类似于作者先前报道的用于人类疱疹病毒的方法。作者通过酵母中的转化相关重组（TAR）技术，从 12 个重叠的野生型或修饰片段（或 “部分”）中组装出了全长的非洲猪瘟病毒 Kenya-IX-1033 “合成” 基因组。

为了完善非洲猪瘟病毒的反向遗传学系统，作者试图使用自辅助病毒（见上文）从组装好的合成非洲猪瘟病毒基因组中重建活病毒。鉴于之前使用红色荧光的非洲猪瘟病毒 CD2v 突变体基因组进行了相关验证，作者组装了一个类似的全长合成基因组，其中整个 CD2v 基因被 mCherry 替换（ΔCD2v::mCh）。

为了克服人工基因组末端带来的问题，作者又尝试使用同源的 Kenya-IX-1033 病毒本身作为辅助病毒，从合成组装的基因组中重建病毒，这将允许通过同源重组修复有缺陷的人工末端。

在从合成组装的基因组中成功重建出具有类似野生型生长特性的病毒后，作者随后试图证明这种合成基因组学反向遗传学系统在以组合式、全基因组方式对非洲猪瘟病毒进行工程改造方面的实用性。为此，作者分别和组合地靶向 A238L、K145R 和 I329L 基因进行缺失并获得了这些活病毒。此外，作者还构建了含有 mCherry 与 CD2v 的 C 端融合体（CD2v-mCh/p12M）或天蓝色荧光蛋白（Cerulean）与 K145R 的融合体（K145R-Cer/p12M）重组病毒，因它们可用于活细胞成像，辅助在感染过程中进行功能表征。