【Nature子刊】加州大学圣地亚哥分校创新：用超声波“唤醒”抗癌基因，重塑免疫治疗

摘要：目前仍亟需对基于CRISPR的技术进行精确控制。在这项研究中，团队设计了一套可通过聚焦超声（FUS）控制的可诱导CRISPR工具，它可以穿透深层并诱导局部热疗，以激活转基因。

【导读】目前仍亟需对基于CRISPR的技术进行精确控制。在这项研究中，团队设计了一套可通过聚焦超声（FUS）控制的可诱导CRISPR工具，它可以穿透深层并诱导局部热疗，以激活转基因。

2024年12月1日，美国加州大学圣地亚哥分校Wang Yingxiao教授团队在期刊《Nature Communications》上发表了题为“Ultrasound Control of Genomic Regulatory Toolboxes for Cancer Immunotherapy”的研究论文。研究结果表明，FUS-CRISPR介导的端粒破坏为嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法治疗实体瘤做好了准备。FUS-CRISPR(a/ee)工具箱可以对癌症治疗的基因组/表观基因组重编程，进行无创和时空控制。

关于CRISPR技术

CRISPR技术的出现，彻底改变了生命科学和医学的许多方面。随后开发的CRISPRa和带有核酸酶致死Cas9（dCas9）的CRISPRi，进一步实现了对内源性基因座的转录和表观遗传修饰，展示了CRISPR在不同层面调控基因组的能力。随着基于CRISPR的技术向转化应用和临床试验推进，安全性/可控性已成为人们关注的主要问题之一，这主要是由于Cas9相关蛋白的免疫原性及其在细胞中长期表达所积累的脱靶效应。

聚焦超声（FUS）可穿透数十厘米深，直接诱导生物组织局部热疗。它已被用于在相对较高的温度（>60℃）下对患者进行组织消融，以及使用热敏启动子（如热休克蛋白启动子（Hsp））在轻度升高的温度（42-43℃）下，控制体内转基因的表达。团队以前曾开发出FUS诱导的CAR（FUS-CAR）-T细胞，这种细胞可被FUS本体激活，用于癌症治疗，并能减少肿瘤外毒性。

在这项研究中，团队介绍了一套基于声遗传学的CRISPR工具，包括FUS诱导的CRISPRa（FUS-CRISPRa）、FUS诱导的CRISPR表观遗传编辑器（FUS-CRISPRee）和FUS诱导的CRISPR（FUS-CRISPR）。研究结果表明，FUS-CRISPR(a/ee) 工具箱可以在多种细胞类型和体内，实现FUS可控的基因组和表观基因组重编程，并可应用于协同癌症免疫疗法。

通过FUS-CRISPR激活肿瘤，以增强CAR-T疗法

与FUS-组相比，团队观察到FUS+组的肿瘤生长明显受到抑制。两组小鼠的存活情况也不同：FUS+组小鼠全部存活，而FUS-组只有40%的小鼠（5只中有2只）对CAR-T疗法有反应，其余60%的小鼠在观察结束时因肿瘤进展而达到安乐死标准。在使用NT FUS-CRISPR肿瘤的对照实验中，FUS-组和FUS+组均接受了CAR-T治疗。与FUS-组相比，FUS+组仅轻度抑制了肿瘤的生长，但存活率无显著差异。有FUS刺激的肿瘤中平均有18.3%的CAR-T细胞，明显高于无FUS刺激的肿瘤中的9.0%。这些结果表明，端粒靶向FUS-CRISPR治疗提高了肿瘤内CAR-T细胞的频率。端粒靶向FUS-CRISPR可以实现超声可控基因组编辑和肿瘤引物，从而实现高效的CAR-T疗法，达到协同治疗的效果。

FUS-CRISPR介导的端粒破坏，提高了CAR-T疗法在体内的疗效。

临床兼容的FUS-CRISPR递送，用于癌细胞重编程和免疫疗法

与未接受FUS治疗的小鼠相比，接受FUS治疗的小鼠的肿瘤生长明显受到抑制。与FUS-组相比，FUS+组的存活率也明显更高（到第38 天，100%对0%）。与未处理的肿瘤相比，经FUS处理的肿瘤中CAR-T细胞的瘤内频率大幅增加（17.8%对5.7%）。FUS处理后还观察到tCD19表达增加，这表明FUS-CRISPR介导诱导了tCD19的表达，而tCD19是synNotch CAR-T细胞的启动抗原。FUS-CRISPR介导的癌细胞体内重编程，能使synNotch CAR-T细胞达到抗肿瘤效果。

FUS-CRISPR的体内递送和激活，实现了synNotch CAR-T细胞疗法。

总结

1. FUS-CRISPR(a/ee)工具箱开发：研究人员开发了一个包含CRISPRa、CRISPRee和CRISPR系统的FUS-CRISPR(a/ee)工具箱，这些系统可以通过聚焦超声（FUS）诱导控制遗传和表观遗传重编程。该工具箱能够在体外和体内多种细胞类型中，实现外源和内源基因的诱导性上调、下调和敲除。

2. 肿瘤治疗应用：通过端粒靶向FUS-CRISPR在肿瘤细胞的端粒位点诱导双链DNA断裂（DSB），增强了细胞毒性CAR-T细胞对肿瘤的体外和体内杀伤效果。

3. 体内基因重编程：利用AAV（腺相关病毒）在体内释放FUS-CRISPR，对肿瘤细胞进行重编程，并为synNotch CAR-T细胞提供能量，以攻击整个癌细胞群体。

4. 提高CAR-T疗法疗效：这些协同策略提高了CAR-T疗法对相对耐药肿瘤的疗效。

5. 免疫反应和组织损伤问题：CRISPR-Cas9蛋白在体内可能诱发适应性免疫反应和组织损伤，而FUS-CRISPR(a/ee)工具箱可以通过及时清除瞬时诱导的基因组和表观基因组调控因子，减轻或规避适应性免疫反应。

6. 超声遗传学的优势：超声波技术结合基因工程和合成生物学，提供了对活体动物遗传学和细胞功能的控制，具有高穿透深度和高时间分辨率。

7. 超声成像技术的进步：声学报告基因（ARGs）和功能超声定位显微镜的发展，使得超声成像能够实现微米级和单细胞级的空间分辨率。

8. 单碱基精度的基因组调控：FUS-CRISPR(a/ee)工具箱可以实现单碱基精度的基因组和表观基因组超声引导调控。

9.模块化设计：FUS-CRISPR(a/ee)可以与不同的CRISPR调控因子和gRNA整合，针对任何可访问的基因组位点进行各种重编程。

10. 未来研究方向：未来的研究可能会侧重于设计更理想的FUS-CRISPR（a/ee）元件，并将这项技术扩展到CAR-T疗法以外的疾病治疗领域。

参考资料：

1.Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816–821 (2012).

2.Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819–823 (2013).