CRISPR文库筛选技术应用指南「第一章」：CRISPR文库基础知识

摘要：CRISPR文库技术是CRISPR/Cas系统的高通量应用。CRISPR文库技术始于2012年Doudna和Charpentier的Cas9-sgRNA突破（Jinek et al., 2012）。2014年，Shalem等人开发GeCKO文库，覆盖18,08

1. CRISPR文库技术的发展简史

CRISPR文库技术是CRISPR/Cas系统的高通量应用。CRISPR文库技术始于2012年Doudna和Charpentier的Cas9-sgRNA突破（Jinek et al., 2012）。2014年，Shalem等人开发GeCKO文库，覆盖18,080个基因，开启全基因组筛选（Shalem et al., 2014）。2015-2016年，Gilbert推出CRISPRa/i（Gilbert et al., 2014），Adamson实现单细胞筛选（Adamson et al., 2016）。2020年后，碱基编辑（Komor et al., 2016）和Cas13文库（Abudayyeh et al., 2017）扩展应用。2024-2025年，体内筛选（如Yan et al., 2024）和临床转化（如Li et al., 2025）成为热点，推动癌症靶点发现和CAR-T优化。

1.1 文库筛选在基因组学研究中的重要作用

CRISPR文库筛选是基因组学研究的一大利器，能一次性研究成千上万基因的功能。传统方法（如RNAi）效率低、特异性差，而CRISPR文库用大量sgRNA集合，结合Cas9敲除、激活或抑制基因，快速找出关键基因。

应用范围：

| 疾病机制研究: 比如2024年用文库筛选肺癌驱动基因（Yan et al., 2024, Nature Biotechnology），揭示肿瘤生长秘密。

| 药物靶点发现: 2025年发现PRC1是肾癌关键基因，为新药开发指路（Li et al., 2025, International Journal of Medical Sciences）。

| 基础生物学: 解析信号通路或细胞必需基因，能够快速填补基因研究空白。

文库筛选还能结合单细胞测序，细化到个体细胞水平，特别适合研究复杂疾病（如肿瘤异质性）。研究显示，它比传统方法快10倍以上，成本更低，推动了基因组学研究从“读”到“改”的飞跃。

2. CRISPR文库基础知识

2.1 什么是CRISPR文库？

2.1.1 CRISPR/Cas系统的基本原理

CRISPR/Cas系统是一种高效的基因编辑工具，起源于细菌的免疫防御机制。它的核心是Cas9蛋白和单导RNA（sgRNA）。简单来说，sgRNA精准定位到基因位置，能识别目标DNA的特定序列，而Cas9则像一把“剪刀”，在sgRNA引导下在特定的位置剪切DNA。研究表明，Cas9识别DNA旁边的PAM序列（通常是NGG），然后在目标位点制造双链断裂。细胞在修复断裂时，常通过非同源末端连接（NHEJ）引入随机错误，导致基因失活。这种机制让CRISPR/Cas成为研究基因功能的强大工具。

2.1.2 CRISPR文库的定义与作用（sgRNA集、高通量筛选）

CRISPR文库是一套包含成千上万sgRNA的集合，每个sgRNA靶向基因组中的一个特定基因。CRISPR文库设计目的是实现“高通量”筛选，也就是一次性对大量基因的功能进行验证。全基因组文库可以覆盖整个基因组（如人类约2万个基因，每个基因设计5条，那就是10万条sgRNA的文库）；如果聚焦特定基因集，例如定位到所有“激酶”就是“激酶文库”，这些指向特定基因的文库就是亚库，也可以依据研究的需要自行合成和制作“定制基因集”的文库。

CRISPR文库被导入细胞后，结合Cas9敲除或调控基因，然后通过施加“选择压力”（如药物或病毒感染），观察哪些基因影响细胞存活或表型？最后用高通量测序分析筛选后的细胞的基因组构成，获得相关基因信息。CRISPR文库的作用在于快速、系统地找到关键基因，比如癌症治疗靶点或病毒感染因子，可以大幅加速了科研进程。

简单汇总，CRISPR文库就是利用CRISPR/Cas系统的精准编辑能力，通过sgRNA集合实现大规模基因筛选。它就像一个“基因功能探测器”，帮助科研工作者高效发现隐藏在基因组中的秘密。

2.2 CRISPR文库如何工作？

2.2.1 基因敲除、激活、抑制三种不同文库的分子机制

CRISPR文库通过CRISPR/Cas系统实现基因调控，主要有三种机制：

| CRISPR Knockout基因敲除：sgRNA引导Cas9蛋白到目标基因，剪切DNA后，细胞用非同源末端连接（NHEJ）修复，常引入错误导致基因失活。这是研究基因功能最常见的方式（Shalem et al., 2014, Science）。

| CRISPRa基因激活：失活Cas9（dCas9）结合激活蛋白（如VP64），不剪切DNA，而是增强目标基因表达，研究功能获得（Gilbert et al., 2014, Cell）。

| CRISPRi基因抑制：dCas9结合抑制因子（如KRAB），阻断基因转录，降低表达水平，适合研究基因沉默效应（Gilbert et al., 2014, Cell）。

图 1 不同的CRISPR系统的工作原理

2.2.2 CRISPR文库筛选是一个高效的过程

分为转染、筛选、分析三步：

| 转染Transfection：将文库（含大量sgRNA）导入细胞群，确保每个细胞携带至少1个sgRNA，覆盖研究的潜在全部目标基因。

| 筛选Screening：施加选择压力，比如药物处理或病毒感染，观察哪些基因影响细胞存活或表型，找出与施加压力相关的基因。

| 分析Analysis：收集存活细胞，用高通量测序检测sgRNA丰度，统计哪些基因被富集或缺失，通过识别关键基因，快速锁定功能基因。

图 2 CRISPR文库筛选流程图

海星生物依托自主研发的CRISPRSeek™文库筛选平台与算法平台，可以提供 CRISPR-KO、CRISPRa （激活）和 CRISPRi（抑制）三大定制文库筛选服务，技术流程覆盖sgRNA设计、病毒包装、细胞转染、高通量测序及数据深度分析全流程，助力基因功能研究与药物靶点筛选。我们以高效、精准、智能的技术平台，满足多样化科研需求。