摘要：吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）的在人胶质母细胞瘤（GBM）等多种癌症中高表达与肿瘤免疫逃逸密切相关，是肿瘤免疫治疗的重要靶标，通过提高IDO1降解效力、增强脑暴露和改善药代动力学特性，有望获得更具潜力的抗癌物。蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）的新型药物

吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）的在人胶质母细胞瘤（GBM）等多种癌症中高表达与肿瘤免疫逃逸密切相关，是肿瘤免疫治疗的重要靶标，通过提高IDO1降解效力、增强脑暴露和改善药代动力学特性，有望获得更具潜力的抗癌物。蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）的新型药物研发策为解决传统药物的局限性带来了新的希望，研究者利用PROTAC技术，针对免疫抑制蛋白IDO1，基于先导化合物NU223612（化合物6），通过调整CRBN配体、连接子和IDO1配体的结构，最终获得化合物NU227326（化合物21），在 U87 GBM 细胞中，化合物NU227326降解IDO1的DC50为5 nM，较化合物NU223612（0.33 μM）提升约66倍，其体内降解作用持续至少48小时，在GBM43等多种癌细胞系中均表现出高效降解能力。化合物NU227326为首次报道具有高效脑暴露的IDO1 PROTAC，为GBM治疗提供新思路，本文通过梳理化合物NU227326的设计和优化策略，可为IDO1蛋白水解靶向嵌合体的设计提供思路。

NU227326（化合物21）的优化过程

药渡CyberSAR系统提供了对IDO1 PROTACs分子的深入解析。系统通过聚类结构视图和原始结构视图，展示了与靶点相关的酶抑制剂及蛋白水解靶向嵌合体，并以研发阶段时光轴的形式呈现潜力Hits。此外，CyberSAR还提供了适应症和试验设计的可视化分析，帮助研发人员快速获取靶向结构信息，开拓研究思路。尽管CyberSAR在本案例分子的初步开发中未被使用，但其在解析和优化药物分子方面显示出巨大的应用潜力。

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研究背景

胶质母细胞瘤（GBM；IDH野生型）是成年人中最常见的原发性恶性中枢神经系统肿瘤，占所有恶性胶质瘤的≥50%。目前，GBM患者的标准治疗方案包括手术切除肿瘤，随后进行辅助放疗和替莫唑胺化疗。尽管采用此积极的治疗方案，GBM患者的生存率仍然很低，中位总生存期（mOS）不足20个月，5年生存率低于10%。癌症免疫疗法是当前研究的热门领域，并且已在多种癌症类型中取得突破。在过去15年中，针对PD-1、PD-L1和CTLA-4的免疫检查点抑制剂（ICIs）的开发，为多种不同癌症类型的患者带来了显著的生存获益。然而，迄今为止，在III期临床试验中研究的广泛患者群体中，ICIs治疗未能改善GBM患者的mOS。

色氨酸（Trp）代谢为犬尿氨酸（Kyn）途径因其在肿瘤诱导免疫抑制中的作用而受到广泛研究。吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）是一种限速酶，可将必需氨基酸色氨酸转化为下游犬尿氨酸代谢物。体外实验表明，低色氨酸或高犬尿氨酸水平会抑制T细胞功能和/或诱导细胞死亡。IDO1在包括胶质母细胞瘤（GBM）在内的多种癌症中普遍高表达，且其高表达与不良预后相关。IDO1作为肿瘤细胞中过表达的免疫检查点，其抑制剂的开发已成为抗肿瘤治疗的重要策略。过去十年间，多种IDO1酶抑制剂（如图1所示的Epacadosta（1）、Navoximod（2）、PF-0684003（3）和BMS-986205（4））已被广泛研究。然而，小分子IDO1酶抑制剂治疗目前普遍未能为癌症患者带来生存获益，这引发了对IDO1是否为有效癌症免疫治疗靶点的质疑。除 IDO1 酶依赖效应外，相关研究团队已证实IDO1还具有介导免疫抑制的非酶功能，这些数据共同支持以下假设：IDO1酶抑制剂在迄今为止的临床试验中未能改善癌症患者生存率的原因之一是由于IDO1的非酶介导机制。因此，必须同时靶向IDO1的酶活性和非酶活性，才能有效抑制免疫抑制并实现胶质母细胞瘤的免疫治疗效果。

结果与讨论

靶向蛋白质降解（TPD）是一种强大的治疗策略，可用于调控以下蛋白质：“不可成药” 蛋白：传统小分子难以靶向的蛋白；具有非酶促有害功能的蛋白：例如通过非催化机制驱动疾病；易对小分子酶抑制剂产生耐药的蛋白：通过降解而非抑制，避免耐药性产生。蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）是一类双功能小分子，通过泛素-蛋白酶体系统实现靶蛋白的特异性降解。过去20年中，PROTACs从概念验证发展为临床候选药物，验证了其在药物化学与发现中的潜力。其不仅为药物研发提供新思路，还可作为化学工具研究蛋白质的生物学功能与非催化作用。因此，开发降解IDO1蛋白的PROTACs以同时抑制其酶活性和非酶活性，是全面阻断IDO1介导的免疫抑制并深入研究其在癌症中作用的前沿策略。

目前已有两种高效IDO1 PROTACs的报道（图2B）：

Hu等人的研究（2020年）：以Epacadostat（化合物1）为IDO1配体，泊马度胺（Pomalidomide）为CRBN配体。在HeLa细胞中DC50 = 2.8 μM，但未进行体内验证。

文献报道研究团队在2022年开发出IDO1 PROTAC化合物6（NU223612），将BMS-986205（化合物4）酶抑制剂作为IDO1靶向配体纳入基于CRBN的PROTAC中，用于颅内原发性脑肿瘤患者。BMS-986205氢键供体少、细胞渗透性和脑渗透更好，对IDO选择性高，其已进入III期临床试验，显示出良好的脱靶及毒性特征，BMS-986205与IDO1结合的X射线晶体结构表明可连接暴露于溶剂的连接子，这为药物的进一步结构修饰和优化提供了方向。化合物6在培养的U87人胶质母细胞瘤细胞中DC50 = 0.33 μM，在脑组织中浓度达2 μM（腹腔注射），并在颅内GBM小鼠模型中降解IDO，延长生存期。

基于前期研究成果，文献报道研究团队进一步筛选、优化IDO1 PROTACs系列化合物，目标包括： 提升降解效力：通过模块化结构修饰（CRBN配体、连接子、IDO1配体）增强三元复合物稳定性；改善脑暴露与药代动力学（PK）特性：调控分子量（MW）、刚性（可旋转键数目）、氢键供体（HBDs）与受体（HBAs）等理化性质，以优化渗透性、吸收、分布、代谢 和排泄（ADME）特性。

本文报道了基于先导化合物6（NU223612）的优化过程，通过系统性结构改造研究其对降解效力、疗效及生物利用度的影响。

高效第二代IDO1 PROTAC的设计

先前报道了第一代降解剂的开发，旨在建立IDO1 PROTAC的概念验证并获取构效关系（SAR）数据。分子对接研究表明，母体IDO1抑制剂化合物4（NU223618，BMS-986205）的苯环暴露于溶剂中，为连接子提供了理想的j结合位点。因此，IDO1降解剂被设计为通过醚键将连接子连接至苯环的3-位（保留抑制剂原有的氯原子）或4-位（取代氯原子）。通过对两种取代方式的截短类似物进行对接研究，进一步探讨了连接子取代位置对IDO1配体与IDO1蛋白结合的影响（图3A）。

当与结合态的IDO1抑制剂（BMS-116）重叠比对时，在4位带有醚-哌啶基团的类似物会使靶向配体发生位移，从而让连接子伸展到溶剂中（图3B和图3D）。这种位移导致配体的酰胺-NH与丝氨酸167（Ser167）之间的相互作用减弱（图3D）。相反，3-位连接醚-哌啶基团的类似物能与母体抑制剂直接重叠，并恢复了酰胺-NH与Ser167之间的关键相互作用（图3C和图3E）。除了恢复这种相互作用外，当连接子连接在4-氯-3位而非4位时，结合位点外的伸展方向会略有改变，因此可能使PROTAC在与IDO1和E3连接酶蛋白结合时形成独特的三元复合物。这些结果表明，与4位取代相比，4-氯-3位取代可能是连接子更理想的连接位点，因此在先导化合物6（NU223612）的初步优化过程中对此开展了进一步研究（图4）。

如先前报道，研究者在初步筛选中研究了多种E3连接酶配体，通过SAR分析表明CRBN型和Von Hippel-Lindau（VHL）型配体均可在PROTAC设计中来诱导IDO1降解。为了改善IDO1降解剂的药代动力学（PK）特性和血脑屏障（BBB）穿透性，基于CRBN的PROTAC更受关注，因为与基于VHL的PROTAC相比，其分子量（MW）更低且可旋转键（RBs）更少。因此化合物6（NU223612）的优化涉及对CRBN配体的简单修饰，特别是通过改变其与连接子支架的取代位置（图4）。大量研究表明，连接子长度和组成对PROTAC的生物活性具有重要影响。由于原始化合物库的SAR数据表明，相较于醚键或氧乙酰氨基型连接基团，与CRBN配体通过氨基连接的连接子更具优势，进一步探究了氨基型连接方式对E3连接酶配体的适用性。通过使用多种连接子模块，柔性聚乙二醇（PEG）连接子可被全部或部分替换为短刚性杂环结构，从而评估低柔性连接子对IDO1的降解效果。基于此，结合初期研究中建立的SAR数据，开发了新一代IDO1系列降解剂。

通过调整连接子在CRBN配体与IDO1配体上的取代位置，研究其对IDO1降解的影响。为定量评估设计的IDO1降解剂的降解效力（DC50）与效率（Dmax），研究者开发并应用了基于U87胶质母细胞瘤细胞系的IDO1蛋白HiBiT降解实验。通过CRISPR/Cas9将HiBiT插入IDO1蛋白的N端，并在经合成PROTAC处理24小时后，通过检测荧光信号衰减来评估降解效果。

早期的IDO1降解剂采用4-位取代的沙利度胺型CRBN配体，因此进一步探索了连接子至CRBN配体5-位取代的可能性。同时，通过分析4-位取代与4-氯-3-位取代苯环的IDO1配体，研究了取代位置对活性的影响。在保持连接子氨基- PEG2-酰胺-哌啶不变的前提下，合成了具有不同CRBN和IDO1配体取代模式的类似物7-9，并评估其IDO1降解活性（表1）。

将CRBN配体的取代位置从4-位改为5-位（化合物7）导致降解活性完全丧失。将IDO1配体取代位置从4-位改为4-氯-3-位（化合物8）同样失去活性。同时调整CRBN和IDO1配体的取代位置（化合物9）导致降解效力显著下降（DC50 > 0 μM）

由于上述微小取代调整导致活性丧失，研究者转向优化连接子结构。将柔性氨基- PEG2替换为刚性连接子骨架，得到化合物10-13。同时为保留部分柔性，在哌嗪与哌啶环之间引入亚甲基单元。完全替换柔性PEG连接子及氢键供体胺基（化合物10）导致活性丧失。将CRBN配体取代位置改为5-位（化合物11），DC50提升至340 nM，但Dmax降至26%。保留CRBN配体4-位取代，并将IDO1配体改为4-氯-3-位取代（化合物12），活性完全丧失。同时调整CRBN（5-位）和IDO1（4-氯- 3-位）取代（化合物13），DC50大幅降至7.6 nM，Dmax达48%，表明刚性连接子在特定取代位置下可显著提升降解活性。

为探究刚性连接子的作用，将中心哌啶环替换为柔性PEG1单元（化合物14-17），结果显示此改构导致降解活性完全丧失，证实完全替换柔性PEG连接子为刚性结构的必要性。进一步缩短活性较优的化合物11和13的连接子长度（去除亚甲基单元），得到化合物18和19：

化合物18（CRBN 5-位，IDO1 4-位）：DC50= 34 nM（较前体提升10倍）， 但Dmax仅21%。化合物19（CRBN 5-位，IDO1 4-氯-3-位）：DC50 = 6.6 nM，Dmax = 51%，效力与效率得到同步提升。

上述结构优化尝试说明连接子刚性化是提升降解活性的关键策略，尤其当连接子连接于CRBN 5-位与IDO1 4-氯-3-位时，可显著增强三元复合物稳定，提高亲和力。连接子长度优化：缩短刚性连接子长度（如化合物19）进一步平衡了效力（DC50 = 6.6 nM）与效率（Dmax = 51%）。

研究数据表明，PROTACs中连接子的化学组成与E3连接酶配体及IDO1配体的取代模式共同决定了其在U87细胞中降低IDO1蛋白水平的能力。此外研究者成功确立了包含CRBN配体5-位取代、IDO1配体4-氯-3-位取代以及刚性连接子的最优结构组合（见图4与表1）。这种协同作用通过生物膜干涉（BLI）实验得到验证，该组合使三元复合物半衰期延长至1039秒（对比柔性连接子的256秒），显著提升了降解效率。

通过初步的连接子与取代位点优化，研究者筛选出化合物13和19，其IDO1降解效力较先导化合物6显著提升。对该系列降解剂的结构修饰分析表明，将柔性PEG连接子替换为含氮杂环的刚性连接子，并结合E3连接酶与IDO1配体的最优取代模式，是提升活性的关键。具体而言，研究发现：取代模式偏好：IDO1配体的4-氯-3-位取代较4-位取代更优，这一趋势与分子对接结果一致（图3E）。结构优化方向：在保留苯环3-位连接子取代的基础上，去除氯原子，以增强靶向配体在结合位点的构象灵活性，同时维持关键相互作用。

基于上述发现，研究者合成了多种3-位取代的IDO1 PROTACs，并通过HiBiT降解实验评估其活性（表2）。

首先研究了化合物13和19的衍生类似物（化合物20和21）。在保持CRBN取代位点与连接子结构不变的前提下，去除IDO1配体上的氯原子后，观察到IDO1降解效力与效率显著提升：

化合物20（对应化合物13的氯原子去除形式）：DC50 = 20 nM，Dmax = 67%；化合物21（对应化合物19的氯原子去除形式）：DC50= 4.5 nM，Dmax= 63%。

为进一步降低分子量（MW），研究者通过移除中心哌啶环缩短连接子长度，得到类似物22和23。结果显示，连接子长度的缩短导致降解活性完全丧失， 表明这一调整破坏了降解剂形成三元复合物并诱导IDO1降解的能力。

高效IDO1 PROTACs 20与21的体外分析

通过HiBit降解实验，化合物20与21被确认为新型IDO1降解剂，其半数降解浓度（DC50）分别为20 nM和4.5 nM（图5A）。为进一步验证其活性，研究者对这两种PROTACs进行了广泛的体外分析：

1. Western blot剂量依赖性验证

在U87细胞中，化合物20与21均呈现剂量依赖性IDO1降解效果（图5B）：

化合物20：在300 nM时达到最大降解率68%； 化合物21：在100 nM时达到最大降解率88%。

2. 犬尿氨酸（Kyn）抑制实验

两者均能剂量依赖性地降低U87细胞中Kyn水平（图5C）。由于化合物21在最低剂量下表现出最高降解效率，进一步在GBM43细胞中验证，结果显示其同样剂量依赖性地减少IDO1蛋白及Kyn水平（图5D-E）。

3. 与对照化合物的比较

母体抑制剂化合物4（NU223618，BMS-986205）：在U87细胞中表现出最强的Kyn抑制活性，25 nM即可几乎完全阻断Kyn生成。 无效对照化合物24：虽含与化合物21相同的IDO1结合基团，但无法结合CRBN形成三元复合物，抑制活性显著弱于化合物21。化合物21在U87和GBM43细胞中均表现出显著高于无效对照的抑制活性。

4. DC50测定

U87细胞：DC50 = 7.1 nM，GBM43细胞：DC50 = 11.8 nM（图5F）。

在HiBit测定和蛋白质免疫印迹分析中，对于强效降解剂20和21都观察到了钩状效应，即在PROTAC浓度增加时，IDO1蛋白水平会升高。尽管由于钩状效应（Hook效应），在较高的PROTAC浓度下IDO1蛋白水平会上升，但Kyn水平随着剂量的增加继续下降（图5C-E），推测因酶抑制作用增强。对母体IDO1抑制剂化合物4（NU223618，BMS-986205）和化合物21的E3连接酶失活类似物（24，NU227428）的分析表明，它们不会导致IDO1的降解（图5G）。

结论

通过综合上述连接子位置、连接子结构和CRBN配体取代位置的优化策略，经过一系列筛选和进一步优化，最终获得了化合物NU227326。该化合物在人胶质母细胞瘤（GBM）细胞中降解 IDO1的DC50达到5 nM，展现出了高效的IDO1降解能力。同时，机制研究表明其降解 IDO1是通过泛素-蛋白酶体系统实现的，且作用可持续至少2天，具备良好的药代动力学特性和持续的药效。综上所述，从先导化合物NU223612到化合物NU227326的优化过程，是一个基于结构和活性关系的系统工程，通过对连接子和配体的精心设计和优化，逐步提高了化合物的性能，为IDO1相关癌症的治疗提供了更有潜力的药物候选物。

文献来源

doi.org/10.1021/acs.jmedchem.5c00026

来源：药渡数据库