摘要：纤维素是地球上最丰富的可再生聚合物，但因其结晶微纤维结构，以及与植物细胞壁中的木质素和半纤维素的结合，使其难以高效降解。传统方法依赖水解酶（如内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶等），但效率有限。近年来，氧化酶（如LPMOs）的发现虽提升了降解能力，但微生物中仍存在大量
原文：https://www.nature.com/articles/s41586-024-08553-z
纤维素是地球上最丰富的可再生聚合物，但因其结晶微纤维结构，以及与植物细胞壁中的木质素和半纤维素的结合，使其难以高效降解。传统方法依赖水解酶（如内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶等），但效率有限。近年来，氧化酶（如LPMOs）的发现虽提升了降解能力，但微生物中仍存在大量未开发的“基因暗物质”。巴西研究团队从长期覆盖甘蔗渣的土壤微生物群落中，挖掘出一种全新金属酶CelOCE，为纤维素转化开辟了新路径！
01
摘要
纤维素的分解是自然界最重要的反应之一，是生物质转化为燃料和化学品的关键。然而，纤维素的微纤维组织及其与植物细胞壁其他组分的复杂相互作用对酶转化构成了重大挑战。本文通过挖掘专门用于木质纤维素降解的微生物群落的宏基因组“暗物质”（功能未知、未分类的DNA），发现了一种氧化切割纤维素的金属酶。这种金属酶通过一种外型机制作用于纤维素，具有 C1 区域选择性，其产物仅为纤维二酸。晶体结构显示，催化铜埋藏在一个紧凑的果冻状卷支架中，该支架具有一个扁平的纤维素结合位点。这种金属酶表现出同二聚体的结构，使一个亚基能够原位生成过氧化氢，而另一个亚基则与纤维素相互作用。表达该金属酶的里氏木霉工程菌株的分泌组在工业相关条件下，促进了经预处理的木质纤维素生物质中葡萄糖的释放，证明了其生物技术潜力。这一发现改变了目前对细菌氧化还原酶系统的理解。此外，它能够将农工残留物转化为增值生物产品，从而有助于向可持续的生物经济过渡。
02 研究内容
1.宏基因组挖掘
研究团队采集了巴西圣保罗州一处堆积甘蔗渣超过20年的土壤样本，通过宏基因组测序技术，分析了其微生物组成（图1a、b）。与未受甘蔗渣污染的土壤相比，SBS样本的微生物多样性显著降低，但富集了多种与木质纤维素降解相关的细菌门类（如UBP4、酸杆菌门等）。通过组装124个高质量宏基因组（MAGs），团队锁定了一个属于未培养细菌门UBP4的菌株，命名为Candidatus Telluricellulosum braziliensis。其基因组携带大量未知功能的糖苷水解酶（GHs）基因（图1c、d）。通过隐马尔可夫模型筛选出8个与碳水化合物代谢相关的候选基因，最终锁定CelOCE——一种序列与已知酶相似度低于30%的全新蛋白。该酶在还原剂抗坏血酸存在下，将纤维素氧化裂解为单一产物——纤维二糖酸（cellobionic acid），且对结晶和无定形纤维素均有效。
图1：长期甘蔗渣覆盖的土壤的宏基因组
2.独特结构
该研究通过结构解析与多种光谱技术揭示了CelOCE的铜配位机制及结构特征，通过对
CelOCE在三种不同状态下的晶体结构解析，表明CelOCE采用紧凑的果冻卷折叠，包括两个反平行的β-片，形成背对背的同型二聚体，活性位点位于亚基两侧，呈口袋状拓扑（图2a）。此外，CelOCE具有独特的铜配位：每个亚基含一个铜离子，配位模式为His44、His46、His84、Gln50和两个水分子（图2b），与已知裂解性多糖单加氧酶（LPMOs）的“三组氨酸”配位明显不同。铜原子埋在活性位点，呈现出口袋状拓扑结构。此外，这个活性位点坐落在一个扁平的界面中（图2c），这种结构安排非常适配与纤维素相互作用。
图2：晶体结构、铜性能与催化要求
3.电子供体和共底物
通过研究揭示了CelOCE酶催化纤维素的氧化还原机制：首先，其严格依赖电子供体（如ASC）激活催化铜，仅在有还原剂时产生产物。其次，共底物需氧或外源过氧化氢，厌氧条件下补充过氧化氢时显示过氧化物酶活性，其产物生成速率与有氧条件相近（0.053 ±0.050 min⁻¹），这表明原位产生的过氧化氢不是CelOCE酶催化的限速因素。其氧化还原机制可能与其同源二聚体结构相关，CelOCE每个亚基的活性部位位于生物组装的相反一侧，可能有助于它在产生过氧化氢方面自给自足。在这个模型中，一个活性中心通过与纤维素相互作用而受到保护，使其免受溶剂的影响；但另一个活性中心可能是自由的，并充当原位的过氧化氢供应商(图3a)，以确保过氧化氢在与纤维素接触的活性中心附近产生，并使其能够有效使用。
4. CelOCE酶的外切型作用模式
该研究揭示了CelOCE酶通过独特的催化界面实现纤维素外切氧化切割的分子机制。首先，其活性位点由铜离子及多个保守氨基酸形成深口袋，计算模型显示可容纳纤维二糖，底物结合模型显示非还原端葡萄糖通过E96/Q50锚定，-1位葡萄糖与F33堆叠使C1靠近催化铜（图3b）。此外，表面刚性环（含PXHXHP保守基序）与C端α-螺旋形成扁平结构，协同促进与纤维素的空间适配。口袋状活性中心和扁平表面拓扑结构这两个独特的催化界面特征，明确地表明该酶以外切模式作用，这种活性氧化还原酶中前所未有的机制提供了新型催化机制范例。
图3：纤维素的识别和提出的切割机制
5.生物技术应用
为了进一步探索CelOCE如何促进植物生物量的转化，研究人员评估了CelOCE与关键纤维素酶的协同作用。 研究结果表明CelOCE与内切纤维素酶联用时具有显著的加性作用。
随后团队将CelOCE基因整合至里氏木霉工程菌株（Trichoderma reesei）中进行了工业化验证，其分泌的酶混合物在工业条件下使预处理甘蔗渣和桉树木质纤维素的葡萄糖释放量分别提高21%和19%（图4）。该酶混合物在65升和300升生物反应器中显著提升生物质转化效率，且成本可控。结果表明，在工业相关条件下，CelOCE可以在体外（外源添加）和体内（在木霉中共表达）促进木质纤维素生物质的转化。
图4：纤维素酶的互补作用
03
总结
本研究发现了一种全新的金属酶——纤维素氧化裂解酶（CelOCE），并对其结构与催化机制进行了解析。CelOCE的发现揭示了自然界中氧化纤维素降解途径的多样性。其独特的结构为人工酶的设计和定向进化提供了新模板。因此，这项研究不仅拓展了自然界纤维素降解机制的认知边界，更通过“基因暗物质”的挖掘，为生物炼制技术注入了创新动力。同时，这项研究增加了我们对全球碳循环构成的机制的理解，并为农业工业残基的生物转化提供了新的解决方案。
供稿：贾敏君
编辑：刘保月 王晓彤 汪禹彤
责任编辑：苏田源 崔志勇
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来源：微生物组