Cell丨一种结合CRISPR筛选和空间转录组学的新方法—Perturb-FISH

摘要：传统的CRISPR筛选技术（如Perturb-seq）结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够分析基因扰动后的转录组变化，但缺乏空间信息，无法解析细胞微环境对基因表达的影响。而光学池筛选（如MERFISH，多重荧光原位杂交技术）虽能提供高分辨率空间转录组

撰文 | 亦

传统的CRISPR筛选技术（如Perturb-seq）结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够分析基因扰动后的转录组变化，但缺乏空间信息，无法解析细胞微环境对基因表达的影响。而光学池筛选（如MERFISH，多重荧光原位杂交技术）虽能提供高分辨率空间转录组数据，但未与CRISPR扰动结合。因此亟需开发一种新方法以填补传统CRISPR筛选在空间和功能解析上的空白。

近日，来自美国博德研究所的Samouil L. Farhi团队在Cell上发表了题为Simultaneous CRISPR screening and spatial transcriptomics reveal intracellular, intercellular, and functional transcriptional circuits的文章。介绍了一种新方法（Perturb-FISH），通过整合CRISPR筛选和成像空间转录组学，实现在单细胞水平同时检测基因扰动、转录组和空间信息，并探索细胞内、细胞间及功能表型的遗传调控网络。

原理上，Perturb-FISH在CRISPR gRNA载体中插入T7启动子，通过原位转录扩增gRNA，结合MERFISH技术对gRNA和mRNA进行多轮荧光探针标记与成像。解决了短序列检测的灵敏度问题，实现了单细胞水平的基因扰动与空间转录组同步分析。利用汉明码方案，通过多轮成像解码gRNA和mRNA的身份，结合图像分割和计算分析生成单细胞水平的表达与扰动数据，显著降低解码错误率（

作者共使用了3种模型进行实验验证。1）THP1巨噬细胞模型。验证Perturb-FISH与Perturb-seq在脂多糖（LPS）响应基因效应的一致性，分析细胞密度和邻近细胞对基因表达的影响。2）hiPSC星形胶质细胞模型：结合钙成像，研究ASD风险基因敲除对钙信号活动及相关分子通路的影响。3）肿瘤异种移植模型：解析肿瘤细胞与浸润T细胞间的遗传互作，揭示免疫调控机制。

通过技术验证，作者证实了Perturb-FISH与Perturb-seq在基因扰动效应上高度一致（Pearson相关性>70%），且仅需20-50个细胞即可获得可靠结果。在空间分辨率下，Perturb-FISH成功捕捉到细胞密度依赖的基因表达变化（如TNF在低密度细胞中上调）和邻近细胞的调控效应（如MYD88敲除上调邻近细胞的TNF）。

利用Perturb-FISH技术，作者获得了3个生物学发现。1）巨噬细胞中NF-κB通路基因（如TRAF6、NFKB1）的扰动效应受局部细胞密度调节。2）ASD风险基因（如USP9X、TRIP12）敲除导致星形胶质细胞钙信号异常，并与mTOR通路、胆固醇代谢基因模块相关。3）肿瘤细胞中NF-κB通路基因（如IRAK1、MAP2K2）敲除影响T细胞激活标志物（如CD8A、TIGIT）的表达，揭示了肿瘤-免疫互作的新机制。