摘要：小肽标签因其紧凑的尺寸减少了靶蛋白干扰，因此具有标记内源性蛋白质的优势。然而，其固有荧光的缺乏给基因组敲入后单克隆筛选带来了挑战。2025年8月29日，中国科学院生物物理研究所徐平勇、Yuan Lin共同通讯在Nature Chemical Biology在线
小肽标签因其紧凑的尺寸减少了靶蛋白干扰，因此具有标记内源性蛋白质的优势。然而，其固有荧光的缺乏给基因组敲入后单克隆筛选带来了挑战。2025年8月29日，中国科学院生物物理研究所徐平勇、Yuan Lin共同通讯在Nature Chemical Biology在线发表题为“ALFA nanobody-guided endogenous labeling”的研究论文。该研究报道了一种灵活的方法，利用抗原稳定荧光蛋白融合纳米抗体 (Nbs) 选择性地照射已成功敲入 ALFA 标签的细胞，从而简化了使用荧光激活细胞分选技术进行的高通量细胞筛选。通过靶向突变和筛选 ALFA Nbs (NbALFA)，可以在缺乏ALFA肽的情况下选择性地降解荧光标记的Nb。相反，成功将 ALFA 肽插入基因组会导致 Nb 的荧光强度显著增加。这项技术被称为 ALFA Nb 引导内源性标记 (ANGEL)，可在原生细胞环境中实现多种多样的应用。这些应用包括通过 ALFA 标签的串联排列进行精确的蛋白质标记和信号放大、动态监测蛋白质行为、启动蛋白质降解过程以及分析蛋白质相互作用组。
人类基因组大约有 20,000 个蛋白质编码基因，据信涵盖超过 1,000,000 种不同的蛋白质形式。检查特定蛋白质的定位、表达和相互作用谱是理解其功能及其调控分子机制的关键初始阶段。瞬时或稳定过表达与报告基因融合的目的蛋白(POI) 是进行功能研究的常见做法。然而，过表达超高分子量的蛋白质具有挑战性，例如核斑点蛋白 SON (264 kD) 或由富含重复鸟嘌呤-胞嘧啶的 cDNA 编码的蛋白质。另一方面，虽然过表达系统有助于实时分析 POI，但细胞蛋白水平经常与内源水平存在显著偏差，可能会引入伪影。例如，生物节律蛋白和细胞周期蛋白的表达水平会波动，并受到特定蛋白质的精确调控。这些蛋白质的过度表达可能会扰乱自然生物节律和细胞周期的平衡。此外，还需谨慎避免过度表达与其表达水平密切相关的关键功能蛋白，例如内质网 (ER) 塑形蛋白细胞骨架相关蛋白 4 (CKAP4，也称为 CLIMP-63) 和网状蛋白 4 (RTN4)。具体而言，CKAP4 在调节外周内质网片层内腔空间大小方面发挥着至关重要的作用，其过表达会导致内质网片层显著增加。相反，RTN4 的表达水平负责促进内质网小管弯曲并调节内质网小管直径，从而调节管腔内容物的运输。因此，在原生遗传背景下分析 POI 的功能对于生物学研究和应用至关重要。随着基于 CRISPR 的基因组编辑工具的发展，将荧光蛋白 (FP) 等基因序列敲入内源性基因组位点可以维持POI 的天然表达和调控模式，并实现对 POI 动态的可视化定量分析。然而，插入片段的大小是需要考虑的主要因素之一，因为较大的插入片段会导致基因组修饰效率降低。因此，HA、FLAG、c-Myc 等小标签已被用于整合到目标基因中进行标记。然而，这些表位标签通常与染料偶联抗体联合使用，进行免疫染色以在固定细胞中定位 POI。值得注意的是，由于这些肽标签不发荧光，在荧光激活细胞分选 (FACS) 等高通量筛选技术尚未普及的情况下，鉴定阳性敲入菌株既困难又费力。基于互补方法的荧光蛋白（FP）或半合成标签的内源性标记，包括将GFP11、sfCherry11或发光HiBiT标签等小片段标签插入基因组，并表达相应的胞内结合伴侣。荧光标记策略可在基因组DNA测序前进行高通量基因敲入鉴定，并在实时成像和蛋白质定量分析中展现出良好的应用前景。然而，由于颜色固定，这些方法并非完美无缺，在功能研究中也存在固有的局限性。纳米抗体（Nbs）是能够与抗原结合的最小抗体，其尺寸约为15 kDa（约2.5 nm×4 nm）。它们具有高稳定性、特异性和亲和力，使其成为生物学研究的多功能工具。在众多强大功能中，带有荧光蛋白标记的纳米抗体（称为染色质体）不仅能够以非侵入性和低光毒性的方式为活细胞标记多种颜色，还能实现超分辨率成像和快速蛋白质动力学研究。然而，染色体高度依赖于靶蛋白，需要为每种独特的蛋白质构建一个特定的染色体，这个过程既繁琐又耗时。因此，开发一种利用通用染色体标记任何POI的技术，将有助于有效地操控和研究蛋白质的生物学功能。ALFA标签是一种设计合理的表位标签，由13个氨基酸组成，形成稳定紧凑的α螺旋结构，使其物理尺寸小于大多数线性表位标签。此外，ALFA标签具有亲水性，可耐受严苛的化学处理，在生理pH值下保持不带电。参考文献[1]中的一项研究还展示了一种专门用于识别ALFA肽（NbALFA）的高亲和力Nb的开发，该系统适用于蛋白质印迹、免疫沉淀和超分辨率成像等多种应用。作者发现NbALFA在细胞内的稳定性取决于ALFA标签的存在。在没有ALFA肽的情况下，NbALFA容易降解。然而，随着细胞内ALFA标签水平的增加，NbALFA的信号也会增强。利用这一特性，该研究设计了一种通用的短肽标记内源蛋白的方法，并将其命名为ALFA Nb引导内源标记（ANGEL）。首先，构建了NbALFA-FP表达盒整合到基因组中的稳定细胞系，以确保在没有ALFA标签的情况下，不同细胞中NbALFA的表达水平保持一致。随后，利用CRISPR技术将ALFA标签精准敲入到指定基因位点，并以NbALFA-FP荧光的改变作为筛选指标，筛选出成功敲入的细胞。为了提高筛选效率，NbALFA经历了突变和进化。NbALFA在关键氨基酸位点的突变筛选（NbALFA）需要满足以下两个条件：(1) 在没有ALFA肽的情况下，NbALFA应尽可能降解；(2) 在存在ALFA标签的情况下，NbALFA信号应尽可能强。此外，由于抗原具有稳定抗体的特性，通过 CRISPR-Cas9 基因编辑（包括初始编辑）成功将 ALFA 标签插入目标基因位点的细胞可以通过NbALFA 存在下增强的荧光信号进行有效识别。使用 ANGEL，可以在天然环境中用 ALFA 标签准确地标记多种蛋白质，例如 CKAP4、内质网膜蛋白SEC61 转运蛋白亚基 β (SEC61B)、RTN4、中间丝波形蛋白 (VIM)、核孔蛋白96 和 35 (NUP96、NUP35)、H2B 聚集组蛋白 21 (H2BC21)、CBX蛋白同源物 1 (CBX1)、核纤层蛋白 A/C (LMNA)、肌动蛋白和核斑点核心蛋白 SON。无论蛋白质序列的复杂程度（例如 GC 含量的变化）或蛋白质丰度水平如何，都可以成功标记。值得注意的是，即使是分子量高达 264 kD 的 SON，也能使用 ANGEL 成功标记串联 ALFA 标签。此外，与拆分 FP 的敲入策略不同，通过使用 PiggyBac (PB) 转座子系统，一旦建立了敲入 ALFA 标记细胞系，就可以完全去除mutNbALFA，从而获得背景无任何残留的细胞系。总而言之，基于 ANGEL 的方法是一种广泛适用且可扩展的策略，能够高效地将一个或多个 ALFA 肽段写入基因组中的特定位置。这使得内源性蛋白质能够通过通用染色体进行多色标记，从而实现不同组织深度的成像，并适用于多种成像模式。此外，ANGEL 能够实时、可靠地研究内源性蛋白质的生物学功能。
图1 ALFA标签增强了NbALFA的稳定性（图源自Nature Chemical Biology）文内所提及文章：[1] Götzke, H. et al. The ALFA-tag is a highly versatile tool for nanobody-based bioscience applications.Nat. Commun. 10, (2019).参考消息： 来源：寂寞的咖啡
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