摘要：引用本文:刘晓光, 陆召辉, 蔡雨辰, 等. 唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9在急性呼吸窘迫综合征患者外周血中的表达作用初探[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2025, 48(2): 123-129. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20
引用本文:刘晓光, 陆召辉, 蔡雨辰, 等. 唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9在急性呼吸窘迫综合征患者外周血中的表达作用初探[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2025, 48(2): 123-129. DOI: 10.3760/cma.j.cn112147-20240620-00350.
摘要
目的通过检测ARDS患者外周血中单核巨噬细胞、中性粒细胞和血浆唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9（siglec-9）的表达水平，探讨其临床价值。
方法收集2021年7月至2022年10月来自南京大学医学院附属金陵医院和芜湖市第二人民医院收治的54例ARDS患者（ARDS组）临床资料和外周血样本；纳入同期住院非重症肺部感染患者（47例）作为肺部感染组，健康志愿者（50名）作为健康对照组。使用流式细胞术和ELISA分别检测细胞和血浆中siglec-9的表达水平。
结果与肺部感染组和健康对照组相比，ARDS组单核细胞和血浆siglec-9表达水平显著升高（PP>0.05）。中重度ARDS患者血浆siglec-9水平显著高于轻度患者（P
结论ARDS患者血浆中siglec-9表达与病情严重程度呈正相关，对ARDS病情评估具有一定的价值。
急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是指肺内外严重感染、创伤、休克等多种原因导致的以急性呼吸窘迫和严重缺氧为临床表现的一种危重症，具有起病急、进展快、病死率高等特点。其中脓毒症是引发ARDS的重要诱因之一。现有的研究认为ARDS发生机制主要为过度的炎症反应形成细胞因子风暴，导致肺毛细血管内皮细胞受损，引发肺毛细血管通透性增加，最终导致肺水肿［1, 2, 3, 4, 5］。唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin-9，siglec-9）与CD33相关，其胞外Ig结构域含有唾液酸结合位点，胞质结构域含有免疫受体酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM），该基序通过募集蛋白酪氨酸磷酸酶1（SHP-1）和蛋白酪氨酸磷酸酶2（SHP-2）调节免疫细胞功能［6, 7, 8］。现有的研究发现，siglec-9大量表达于中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞，少量表达于B细胞，而血浆中和巨噬细胞培养上清中可检测到可溶性siglec-9（ssiglec-9）［9, 10, 11］。先前的研究表明siglec-9具有调控免疫检查点的作用。例如中性粒细胞和单核细胞中的siglec-9在产生活性氧后可诱导自身发生凋亡；在肿瘤微环境中，siglec9阻断可以显著降低体内肿瘤负荷［12, 13］。除此之外，siglec-9激活后可抑制中性粒细胞活化，具有减轻机体炎症反应，起到免疫抑制的作用［14］现有的研究表明，siglec-9的表达水平与脓毒症、COVID-19和炎症性肠病密切相关，有作为炎症性疾病治疗靶点的潜力［15］。目前尚缺乏siglec-9与ARDS相关的临床研究。为此，本研究对 ARDS 患者血浆、中性粒细胞和单核细胞中的siglec-9表达水平进行了检测，并探讨siglec-9表达水平对ARDS 患者病情评估和预后预测的价值，旨在为 ARDS 的临床诊疗提供参考。对象与方法
1.临床资料及分组：外周血样本来自南京大学医学院附属金陵医院呼吸与危重症医学科和芜湖市第二人民医院呼吸内科2021年7月至2022年10月期间收治的ARDS患者（柏林定义），同期纳入体检中心志愿者及住院肺部感染患者作为对照组。最终纳入研究的队列包括ARDS患者病例54例（ARDS组，其中金陵医院47例，芜湖市第二人民医院7例），肺部感染患者47例（肺部感染组，其中金陵医院45例，芜湖市第二人民医院2例），体检健康对照组50名（均来自金陵医院）。所有参与者均签署了书面知情同意书。研究获得金陵医院伦理委员会和芜湖市第二人民医院伦理委员会批准。
肺部感染患者纳入标准：（1）新近出现的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病症状加重并出现脓性痰，伴或不伴胸痛；（2）发热；（3）肺实变体征和（或）闻及湿性啰音；（4）白细胞计数>10×1099/L，伴或不伴中性粒细胞核左移；（5）胸部X线检查显示片状、斑片状浸润阴影或间质性改变，伴或不伴胸腔积液。以上1~4 项中任何1项加第5项，除外非感染性疾病作出诊断。排除标准：年龄ARDS患者纳入标准：符合柏林定义的肺内型ARDS患者。排除标准：年龄
收集ARDS组和肺部感染组患者的临床资料，包括人口统计学资料：年龄、性别、BMI；实验室检查：红细胞计数、白细胞计数、血小板计数、单核细胞计数、C反应蛋白、白细胞介素-6（IL-6）、乳酸脱氢酶、氧合指数等资料，其中氧合指数取确诊2 d内最低值；感染类型确定：mNGS、支气管肺泡灌洗液培养或痰培养明确检出致病病原体。按照急性生理与慢性健康评分（APACHE Ⅱ）标准，对ARDS患者进行APACHE Ⅱ评分。收集健康对照组人口统计学资料：年龄、性别和BMI。
2.检测方法：（1）收集患者外周血样本。在确立ARDS诊断72 h内，采集外周静脉血（含EDTA真空负压抗凝管）2 ml，采集标本后2 h内进行血浆分离。使用离心机于室温，3 000 r/min离心15 min分离血浆，离心距离：10.5 cm。分离后的血浆分装于冻存管中，标注信息后立即置于-80 ℃冰箱保存（芜湖市第二人民医院的血浆样本在干冰保存下送至金陵医院统一检测）。（2）血浆siglec-9测定。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法定量检测，siglec-9 ELISA试剂盒购自美国R&D公司（美国明尼亚波利斯），按照说明书进行检测。（3）细胞表面siglec-9检测。取患者全血100 μl置于2 ml离心管中。加入流式抗体5 μl，用移液枪轻轻吹打混匀，冰上避光孵育30 min。加入红细胞裂解液2 ml，冰上裂解5 min，350 ×g室温离心5 min。弃上清留沉淀，用移液枪吸弃多余液体，加入PBS缓冲液2 ml用移液枪轻轻吹打混匀，350 ×g室温离心5 min，重复2遍，用移液枪吸弃多余液体，去除红细胞碎片。加入500 μl PBS缓冲液重悬细胞，用移液枪转移至流式管中，使用流式细胞仪进行检测。所用流式抗体（CD14、CD15和siglec-9）均购自美国Biolegend公司。
3.统计学方法：计量资料进行正态性检验，符合正态分布的变量采用均数±标准差描述，组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以中位数［四分位数范围（IQR）］描述，两组之间的比较采用Mann-WhitneyU检验。分类变量按比例分组，使用Pearson的Chi-square检验或Fisher的精确检验进行比较。两组以上的连续性变量比较，符合正态分布者使用采用了One-way ANOVA，不符合正态分布者采用Kruskal-Wallis检验。采用多因素 logistic回归分析探讨ARDS患者独立危险因素，统计分析使用SPSS 24.0软件进行。P
结果
1.ARDS组患者的siglec-9表达水平升高：为检测单核细胞和中性粒细胞中siglec-9表达在ARDS患者中的表达水平，共送检健康对照组7名、肺部感染组8例、ARDS组7例患者血液样本进行流式检测。使用CD14+和CD15-标记单核细胞，使用FlowJo软件设门去除粘连细胞后，分析CD14+单核细胞表面的siglec-9阳性细胞的平均荧光强度，发现与肺部感染组和健康对照组相比，ARDS组患者单核细胞表面siglec-9表达显著升高。用CD14-和CD15+标记中性粒细胞，三组间中性粒细胞表面siglec-9表达差异无统计学意义。2.ARDS患者的血浆siglec-9表达水平升高：使用ELISA试剂盒检测ARDS组54例患者、肺部感染组47例患者及健康对照组50名受试者血浆中siglec-9表达水平。3组患者基线特征见表1。与肺部感染组和健康对照组相比，ARDS组血浆siglec-9表达水平显著升高（图1）；肺部感染组和健康对照组两者血浆siglec-9表达水平差异无统计学意义。
3.ARDS患者危险因素的单因素分析（表2）：两组间的单因素分析显示，ARDS组的血浆siglec-9水平、白细胞计数、血小板计数、乳酸脱氢酶、CRP和IL-6显著高于肺部感染组（PP>0.05）。
4.血浆siglec-9为发生ARDS的独立危险因素：本研究将是否诊断为ARDS作为应变量Y，ARDS患者赋值为1，肺部感染患者赋值为0。以单因素分析结果中有统计学意义的血浆siglec-9、血小板计数、白细胞计数、IL-6、CRP、乳酸脱氢酶作为因变量。多因素logistic分析结果提示IL-6、乳酸脱氢酶以及血浆siglec9为ARDS的危险因素，结果见表3。
5. 血浆siglec-9与ARDS患者疾病严重程度相关：为进一步分析血浆siglec-9与ARDS患者疾病严重程度之间的关系，根据氧合指数将ARDS患者病情分级，其中轻度与中重度ARDS患者的基线资料比较和单因素分析结果见表4。将其中有统计学差异的指标血浆siglec9、IL-6、APACHE Ⅱ、CRP、红细胞计数，进行多因素logistic回归分析（表5）。结果提示血浆siglec9、IL-6、APACHE Ⅱ为中重度ARDS患者的独立危险因素。
6. 血浆siglec-9与ARDS患者预后：随后本研究评估了血浆siglec-9与ARDS患者预后的关系。但根据最终结局是否院内死亡，进行分组，发现两组间无显著性差异，尚未发现血浆siglec-9与ARDS患者的死亡有关。
讨论
ARDS的病理特征是肺弥漫性炎症损伤导致肺泡屏障破坏，临床上表现为顽固性低氧血症和快速进展的呼吸窘迫。不可逆的炎症因子风暴被认为是ARDS的重要发病机制之一。最近一项研究发现，新冠重症患者中高水平的IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与较差的预后显著相关［16］。siglec-9具有调节免疫检查点的作用，在肿瘤相关性疾病中发挥重要的作用，在胶质瘤患者中siglec-9高表达患者的生存概率明显低于siglec-9低表达患者，其表达水平与髓源性抑制细胞浸润呈正相关［14］。在感染性疾病中，通过分析新冠肺炎患者中性粒细胞的转录组学结果发现，重症新冠肺炎患者的中性粒细胞siglec-9的表达明显升高［15］。而在本研究中，ARDS患者外周血单核细胞siglec-9表达明显高于肺部感染患者和健康对照组，这提示单核细胞的siglec-9表达水平与病情的严重程度是相关的。但这三组间中性粒细胞siglec-9表达有升高趋势，并无显著性差异。这可能与中性粒细胞寿命短，易发生凋亡有关。
siglec-9不仅表达于细胞膜上，血浆、肺泡灌洗液、细胞上清中也检测出可溶性siglec-9。目前的研究表明，可溶性siglec-9主要通过以下两个机制发挥作用。一是与自身含唾液酸相关的受体结合，Toll样受体（toll-like receptor，TLR）上有唾液酸修饰，siglec-9可以通过唾液酸与TLR4和趋化因子配体2（CCL-2）受体发生免疫共沉淀。这说明siglec-9可作用于唾液酸修饰的免疫受体，发挥免疫调节作用［17, 18, 19］。如可溶性siglec-9主要通过与单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）协同作用来调控巨噬细胞，抑制其促炎因子的合成发挥作用。二是封闭病原体表面唾液酸，现有的研究表明，某些链球菌中可表达与siglec-9配体相似的唾液酸，其与相关免疫细胞膜上siglec-9结合后，会抑制免疫细胞的炎症反应，从而产生免疫逃避的作用。而可溶性siglec-9可中和细菌表面的唾液酸，抑制细菌的免疫逃逸［20］。近年来已有研究证明，可溶性siglec-9有利于神经损伤的修复、减轻急性肝损伤和风湿性关节炎小鼠模型的炎症损伤［21, 22, 23］。但这些研究基本局限于动物和细胞实验。对于各类疾病中，人体血浆中siglec-9表达水平及其与疾病关系的相关研究甚少。对于人体血浆siglec-9在ARDS患者中的诊断和预后作用尚缺乏相关的临床证据。本研究通过多因素logistic分析发现，血浆siglec-9为发生ARDS的危险因素，有作为ARDS治疗靶点的潜力。本研究中我们验证了血浆siglec-9与ARDS患者疾病的严重程度之间的关系，此外，中重度患者血浆siglec-9表达水平显著高于轻度患者，这提示血浆siglec-9表达水平与ARDS患者病情轻重有关。通过多因素 logistic 回归分析，本研究发现血浆siglec-9与APACHE Ⅱ评分、IL-6同为发生中重度ARDS患者的危险因素，这表明血浆siglec-9对ARDS的病情评估价值具有一定价值，也从侧面证实siglec-9的上调可能是机体发生过度炎症反应的标志。
在对肺部感染患者和ARDS患者的临床特征进行分析后，可以看到肺部感染患者的IL-6显著低于ARDS组。这表明ARDS患者的整体炎症水平高于普通肺部感染患者。siglec-9的升高可能受到促炎因子的调控。有研究表明，脂多糖（LPS）能上调小鼠巨噬细胞以及小胶质细胞siglec-E的表达［21］。除此之外，单独使用IL-6或TNF-α也能在体外上调中性粒细胞表面siglec-9的表达［22］。siglec-9的上调可能是机体发生过度炎症反应的标志之一，是机体启动免疫抑制，避免过度炎症损伤自身的重要调节机制之一。但对于细胞外siglec-9的生成机制尚不明确，有待后续研究。在本研究中，暂未发现siglec-9对ARDS的死亡有预测价值，可能由于研究纳入的样本量过少所导致。此外，我们未能对研究对象进行多个时间点采样，未能动态分析研究对象血浆中siglec-9的变化趋势。由于ARDS患者的异质性较大，诱发ARDS的因素也多种多样，将来可根据ARDS患者的不同特征划分为不同的亚型进一步比较。如根据ARDS患者炎症因子的表达高低，可将ARDS患者划分为高炎症亚表型和低炎亚表型。与低炎症亚型相比，高炎型ARDS的sTNFr-1、IL-8和IL-6等炎症因子水平更高。也有文献报道高炎症亚型患者临床预后更差，表现为患者病死率更高以及呼吸机脱机天数更短，尽管ARDS直接和间接危险因素在两个亚型中差异存在统计学意义，但脓毒症、肺炎和误吸等最常见的 ARDS 危险因素在两组中都非常普遍，并不能完全以高炎症亚表型代表脓毒症、肺炎和误吸诱发的ARDS［14，24, 25］。根据这些生物标志物对ARDS进一步细分为不同的亚型，进行更加个体化的诊治，可能是解决ARDS这类综合征的重要方向。后续的研究或许可以将ARDS分成不同的亚型，进一步检验siglec-9在不同ARDS亚型中发挥的作用，能进一步揭示siglec-9在ARDS中的作用机制。综上所述本研究从siglec-9出发，观察性研究了ARDS患者单核细胞、中性细胞以及血浆siglec-9表达水平，为研究ARDS的发病机制和病情评估提供了新的客观依据。但siglec-9对ARDS的预后是否有预测价值，仍需大样本量论证，可见本研究仍不全面，且有局限性；不仅如此，血浆中siglec-9和细胞中siglec-9之间的变换关系尚不明确；本研究为回顾性研究，所纳入的观察例数有限，也可能导致结局的偏倚，还应进一步加强观察和研究，延长观察时间，以充分阐明sigelc-9在 ARDS 患者的中发挥的生物学作用。
来源：呼吸科空间