Cell Genomics | 广州医科大学等单位联合开发单细胞CRISPR扰动技术破解复杂遗传位点调控难题，揭示隐性调控新机制

摘要：在人类基因组中，超过90%的疾病相关遗传变异藏身于非编码区域，这些区域如同"暗物质"，其调控机制的复杂性——尤其是高度连锁不平衡（pLD）区域的因果变异与基因互作——长期阻碍着功能基因组学研究与精准医学发展。8月28日，广州医科大学附属妇女儿童医疗中心、天津医

在人类基因组中，超过90%的疾病相关遗传变异藏身于非编码区域，这些区域如同"暗物质"，其调控机制的复杂性——尤其是高度连锁不平衡（pLD）区域的因果变异与基因互作——长期阻碍着功能基因组学研究与精准医学发展。8月28日，广州医科大学附属妇女儿童医疗中心、天津医科大学、宁波大学附属妇女儿童医院等单位联合一项发表于《细胞·基因组学》（Cell Genomics）的重磅研究，通过创新的单细胞CRISPR干扰（CRISPRi）与激活（CRISPRa）联合扰动技术，首次在复杂遗传位点中系统解析了功能调控元件（CRE）的"多因果"调控模式，并揭示了传统方法难以捕捉的"隐形"调控机制，为解码复杂性状与疾病的分子基础提供了全新工具。

复杂位点的"统计黑洞"：传统方法的无力与挑战

大多数复杂性状相关的遗传位点都位于非编码区，且受连锁不平衡（LD）干扰，导致无法通过传统关联分析准确定位真正的因果变异。例如，两个高度连锁的变异可能共同影响基因表达，但传统eQTL定位或计算工具因无法区分它们的独立效应，常陷入“统计黑洞"。

传统研究中，功能调控元件的识别依赖表观遗传标记（如开放染色质、组蛋白修饰）或计算预测模型，但这些方法在复杂LD区域的准确性受限。例如，部分调控元件可能在生理条件下不表现经典表观特征（被称为"未标记调控元件"，URE），导致被现有工具遗漏；而多因果调控（即一个基因表达受多个独立变异共同影响）的存在，更使传统统计模型难以准确估计单个变异的效应。

单细胞CRISPR扰动：在"原生环境"中解码调控真相

利用多重单细胞CRISPR干扰/激活扰动技术鉴定完美连锁不平衡区域中因果eQTL标记的顺式调控元件

为突破这一瓶颈，研究团队创新性地采用单细胞CRISPRi/a联合扰动技术，在人源近单倍体白血病细胞系（HAP1）中，对81个独立eQTL信号（包含217个高度连锁的"引导变异"，LEV）的调控元件进行系统性扰动。CRISPRi通过失活Cas9（dCas9）结合抑制域（KRAB）沉默目标区域，CRISPRa则通过dCas9结合激活域（VP64）增强表达，两种技术的结合使研究人员能在单细胞水平同时观测多个调控元件的功能。

团队设计的sgRNA库覆盖了每个LEV附近的调控区域（±50bp），并通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析扰动后的基因表达变化。实验共检测到14,481至17,709个单细胞转录组，覆盖了90%以上的sgRNA，确保了数据的可靠性。

CRISPR扰动揭示了完美连锁不平衡信号中因果性顺式调控元件（eCRE）与其靶基因间的多样化调控模式

四大核心发现：改写复杂位点调控认知

eCRE扰动与eQTL定位调控效应的示意图及比较

通过分析扰动后的基因表达与染色质状态变化，研究团队得出四大突破性结论：

1.pLD区域普遍存在"多因果"调控：在81个pLD信号中，62%（51个）包含至少一个因果CRE，其中41.1%（33个）存在2-6个因果CRE，形成"多站点顺式调控"。更令人惊讶的是，45.1%的pLD信号同时调控多个靶基因（包括远端基因），例如rs1049359标记的CRE不仅调控邻近基因，还影响800kb外的CALD1基因。

2.超三分之一功能元件"隐形"，传统注释失效：通过对比扰动前后的表观遗传状态，研究团队发现，36%（29/80）的因果CRE在扰动前缺乏经典表观标记（如开放染色质、H3K27ac等），属于"未标记调控元件"（URE）。例如，rs73156934标记的URE虽无经典表观特征，却通过增强子活性远距离调控CALD1表达，且在CRISPRi扰动后显著改变染色质可及性。

3.现有计算工具难以预测内源性调控效应：评估20种主流功能预测工具（如Eigen-PC、GenoCanyon）发现，其在区分因果CRE与非因果元件时表现不佳（AUC多低于0.6）。深度学习模型Enformer虽能捕捉部分序列效应，但与实验结果的吻合度仍有限。这提示现有模型因依赖常规表观特征或单一组织数据，难以解析复杂LD区域的动态调控。

4.基因组调控具有高度可塑性：通过比较CRISPRi与CRISPRa的扰动效应，研究团队发现24%的CRE在抑制时反而上调基因表达，11个CRE在两种扰动下均显著影响表达。进一步分析显示，这种"反向调控"多发生于远端区域（>100kb），可能与三维基因组的高级结构（如染色质环）或复合调控元件（同时含激活与抑制位点）有关。

技术验证与应用前景：从实验室到临床的桥梁

这项技术的核心优势在于在"原生染色质环境"中直接观测调控效应，避免了传统外显子报告实验（MPRA）脱离生理背景的局限。它不仅能帮助我们更准确地定位GWAS中的因果变异，还能揭示疾病中"缺失的调控层"——例如，为什么许多非编码风险变异无法通过eQTL定位解释表型？答案可能藏在pLD区域的多因果调控或URE中。

目前，研究团队正将这一技术扩展至更多细胞类型（如免疫细胞、神经元），并探索其与单细胞多组学（如染色质构象捕获）的整合，以构建更全面的调控网络图谱。这项研究不仅为复杂遗传位点的功能解析提供了"金标准"工具，更揭示了人类基因组调控的复杂性与可塑性，挑战了"经典表观标记是调控元件必要条件"的传统认知。随着单细胞技术与基因编辑的不断融合，相信在不远的将来，更多"隐形"的调控机制将被揭开，为精准医学的发展注入新的动力。

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