摘要：本文对二里头遗址出土、年代涵盖二里头文化三期早段到二里岗文化晚期的22例牛骨线粒体DNA控制区285bp的片段进行分析研究，其中13例获得了所需要的DNA序列，DNA分析表明它们全部都属于家养普通牛（Bos taurus）。结合已发表二里头遗址出土黄牛的DNA

本文对二里头遗址出土、年代涵盖二里头文化三期早段到二里岗文化晚期的22例牛骨线粒体DNA控制区285bp的片段进行分析研究，其中13例获得了所需要的DNA序列，DNA分析表明它们全部都属于家养普通牛（Bos taurus）。结合已发表二里头遗址出土黄牛的DNA研究成果可以看出，作为一个整体，二里头遗址家养普通牛属于8个单倍型，可以归属于三个单倍型类群，以T3为主占81.8%，T4次之占13.6%，T2仅发现一例个体占4.5%。这一遗传结构特征符合中原地区古代黄牛的遗传结构模式。二里头文化时期与二里岗文化时期的黄牛遗存线粒体DNA单倍型类群的主体结构没有明显的差异，具有母系遗传连续性。在中原地区先秦时期家养普通牛的发展过程中，二里头遗址的家养普通牛处于承上启下的位置。

动物考古学研究表明二里头遗址出土的动物遗存以家养动物为主，包括狗、猪、羊和黄牛等，所占比例非常高。本文对二里头遗址1999～2006年度考古发掘出土的牛骨进行DNA提取与分析。关于这批牛骨的DNA研究，蔡大伟等前期做了部分工作[1]，采集牛骨样本15个，年代集中在二里头文化四期早段至二里岗文化晚期。共获得其中9个样本的线粒体DNA控制区（mtDNA D-loop）序列，以单倍型类群T3为主，还包括有少量的T2和T4。考虑到二里头遗址的重要性和遗迹的复杂性，以及遗址涉及的年代分期广泛和黄牛遗存出土数量的的庞大，仅有几个数据并不能代表二里头遗址出土黄牛遗存的全部情况。为了能够更加全面地揭示二里头遗址黄牛的遗传结构特征，在前期工作的基础上本文进行了样本量的扩充。在对黄牛遗存保存状况进行初步评估的基础上，一方面有意识地选择年代相对较早的样本（二里头文化三期），另一方面重点选择灰坑出土样本。希望本研究能够扩大二里头遗址和中原地区黄牛的古DNA遗传数据，并基于此探讨二里头遗址不同时期黄牛的遗传结构动态变化规律。

一、材料与方法

1.样本采集与前处理

本研究采集的22例牛骨样本，其中出自灰坑的13例、灰沟1例、地层8例，年代跨度为二里头文化三期早段至二里岗文化晚期。在样本选取过程中，为了避免重复取样，主要选择与已发表黄牛DNA数据不同的遗迹单位，或者DNA提取失败的遗迹单位；对同一遗迹出土样本，尽量选择同侧同部位的样本，或者通过形态、大小等可以明确区分属于不同个体的样本。采集样本的具体信息见表一。

样本前处理首先选取骨骼上大约1×1平方厘米的小块，用钻头打磨骨骼表面和切割面，以去除表面尘垢。使用次氯酸钠溶液（有效氯6％）浸泡骨骼约10分钟，紫外照射2小时（紫外灯置于样本以上8厘米的高度，波长254nm，UVP，美国），每小时翻面，以去除样本表面的外源DNA污染和采样过程中可能存在的样本间的交叉污染，该步骤可以保证样本本身内源DNA受到最小的损害[2]。使用冷冻研磨机FREEZER/MILL 6750（SPEX，美国）将样本打磨成粉，-20℃保存备用。

2.DNA提取

DNA提取采用硅柱离心法，该方法基于商业化试剂盒

PCR Purification Kit（Qiagen，德国），最早由Yang等提出[3]。取大约0.2～0.5克骨粉放入15毫升离心管中，加入裂解液3毫升（0.5M EDTA，0.5％SDS，0.4mg/mL蛋白酶K），52℃孵育过夜以裂解细胞胶原蛋白和溶解骨骼中的矿物质，使用

Ultra-4离心超滤管（10K，Merck，德国）将裂解液浓缩至100微升，之后按照试剂盒说明书操作进行DNA提取，最后洗脱得到DNA提取液约100微升，-20℃保存备用。

3.PCR扩增与测序

选择引物L1269/H1346[4]扩增线粒体基因组中12S rRNA基因的片段（76bp），目的是对所选取的样本进行初步地种属鉴定。经过分子筛选得到的牛属（Bos）样本，选择Yang等[5]、Troy等[6]、Cai等[7]设计的四对套叠引物扩增黄牛线粒体DNA控制区的片段，可获得331 bp的序列（16004～16334，包括引物长度）。

PCR反应体系均为30微升，包括4～5微升的DNA提取液，1～

3U AmpliTaq

（

Thermo Fisher，美国），50mM KCl，

2.5mM

，

0.2mM dNTP Mix和0.3微摩引物。PCR扩增程序如下：95℃12分钟，随后是94℃变性30秒、52～55℃退火30秒、72℃延伸40秒共60个循环，最后72℃延伸10分钟。

在古DNA研究的PCR扩增中常用BSA（牛血清白蛋白，具有降低腐殖酸污染引起的抑制等作用）以提高扩增效率。本文实验研究对象是古代牛DNA样本，考虑到BSA试剂本身是从牛组织中提取的，为了避免可能的污染风险，所以全部实验都没有使用BSA。

PCR扩增产物使用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，全部阳性产物送至商业化DNA测序公司，正反引物双向直接测序（Sanger法）。

4.数据分析

使用Chromas Pro软件对获得的线粒体DNA序列进行读取和检测，使用Clustal X2软件[8]进行DNA序列比对，使用BioEdit软件[9]进行编辑和拼接。使用MEGA 7软件[10]构建系统发育树（图一）。使用Dna-SP（v.6.12.03）软件[11]和Arlequin（v.3.5）软件[12]计算单倍型多样性与核苷酸多样性；使用PopART（v. 1.7）软件[13]构建中介网络图（图二，A），使用TempNet R程序[14]构建中原地区古代家养黄牛的分层网络图（图二，B，按照遗址年代划分层次）。选择中国考古遗址出土家养普通牛作为对比序列，包括山西陶寺、山西周家庄、河南王城岗、河南花地嘴、河南望京楼、河南二里头、河南殷墟孝民屯、陕西泉护村、陕西石峁、吉林后套木嘎、内蒙古大山前、青海喇家、青海长宁、宁夏打石沟、宁夏沙塘北塬、宁夏王大户、宁夏中庄、宁夏九龙山、新疆小河等遗址出土遗存[15~26]。

5.防污染措施

全部实验都在专门的古DNA实验室完成，严格按照古DNA操作规范进行。所有样本都独立提取2次以上，且每次DNA提取与PCR扩增都设置空白对照，用以判断实验过程中是否存在外源污染。全部DNA片段都进行正反引物双向测序且得到完全一致的结果，用以识别和排除实验中可能存在的误差。所获得的DNA序列都得到了重复验证。

二、结果

在22例样本中，有21例获得了线粒体基因组中12S rRNA基因76bp的DNA序列（表一，BOC193在该片段的PCR扩增失败），在GenBank数据库中对这些DNA序列进行了BLAST共享序列搜索，结果发现有20例属于牛属（Bos），有1例（BOC185）属于鹿属（Cervus）。其中13例样本获得了线粒体DNA控制区的285bp序列（16029～16313，去除两端引物），在GenBank数据库中对这些DNA序列进行了BLAST共享序列搜索，结果发现全部样本都属于家养普通牛（Bos taurus）。

BOC185未获得线粒体DNA控制区序列，应该是与其种属为鹿属有关。BOC189、BOC193、BOC194、BOC196、BOC197、BOC198、BOC201和BOC202都未获得线粒体DNA控制区的序列，推测可能和DNA保存较差有关。这些样本在L1269/H1346引物扩增成功，其他引物扩增失败，符合古DNA的特点，它们的线粒体基因组12S rRNA基因的DNA序列结果可以确定为牛属，但是无法进一步判断所属种，因此不再作进一步分析。

以V00654[27]作为参考序列，将属于家养普通牛的13个线粒体DNA控制区序列与之进行比对，实验结果见表二。共检测出6个多态性位点，全部为转换，没有颠换、插入或缺失，转换在嘧啶之间的比例高占66.7%（4/6），遗传多态性不高。在这13个序列中共检测出6个单倍型，BOC182、BOC184、BOC191、BOC192和BOC195，BOC183和BOC188，BOC186和BOC187，BOC190和BOC199分别共享有相同的单倍型。根据已发表研究成果关于普通牛单倍型类群的划分[28~31]，基于线粒体DNA控制区序列变异模式，这6个单倍型可以归属于2个单倍型类群T3和T4，以T3为主占84.6%，T4次之占15.4%，未见其他单倍型类群。

三、讨论

考古发掘年代早的动物骨骼非常珍贵且经常被破坏严重，当不易进行形态观察和研究时，古DNA研究可以发挥其优势，从小的骨片中提取出DNA进行分析，在一定程度上弥补形态学的局限与不足。本文的研究对象黄牛与大型鹿科动物在很多骨骼部位都有相似性，尤其是种属判断的关键特征部位残破甚至缺失的情况下，仅仅依据形态学观察很难明确种属。例如本文样本BOC185是从残破的头骨中取出的颞骨岩部，初步的形态学鉴定推测为黄牛，但是经过DNA提取与序列比对后发现，该样本应为鹿属。因此，古DNA技术可以为动物考古学的种属鉴定提供必要的分子生物学方面的证据。

关于中国古代黄牛的DNA研究，最早的是2011年蔡大伟等[32]对新疆小河、青海长宁、内蒙古大山前三个青铜时代遗址的黄牛进行的线粒体DNA研究，此后该研究团队又陆续发表多个北方地区考古遗址出土牛骨的DNA研究成果[33~38]，其中也包括本文前面所述的二里头遗址出土黄牛的DNA研究情况。

在上述研究的基础上，本研究将二里头遗址黄牛的样本量进行了扩充，与已发表成果进行综合统计与比较（表三），尝试得出新的认识。目前二里头遗址出土黄牛线粒体DNA控制区序列共有22个，全部属于家养普通牛（表二；图一），分别属于8个单倍型（图二，A，Hap_1～Hap_8），年代从二里头文化三期早段至二里岗文化晚期。作为一个整体来看，这些普通牛可以归属于三个单倍型类群，以T3为主占81.8%，T4次之占13.6%，T2仅发现一例个体占4.5%。该遗传结构特征符合中原地区古代黄牛的遗传结构模式[39]。因为所选取样本年代跨度较大，依据二里头遗址的分期，将所选取样本也进行分期，分为二里头文化三期、二里头文化四期、二里岗文化早期、二里岗文化晚期四个阶段，比较不同阶段普通牛遗传结构变化规律（表三）。二里头文化时期的样本共16个，归属于三个单倍型类群，以T3为主占81.25%，T4次之占12.5%，T2一例个体占6.25%。其中二里头文化三期共3个样本，包括T3和T4；二里头文化四期共12个样本，包括T2、T3和T4；ELT14的出土层位属于二里头文化时期，在统计过程中仅归入二里头文化的分期内，进一步分期比较中并未包括其中。二里岗文化时期的样本共6个，归属于二个单倍型类群，以T3为主占83.3%，T4仅发现一例个体占16.7%。二里岗文化早期仅有1个样本属于T3；二里岗文化晚期共5个样本，包括T3和T4。

二里头遗址家养普通牛的单倍型共有8个（Hap_1～Hap_8），Hap_1、Hap_6、Hap_7和Hap_8都只有一个样本。Hap_1、Hap_6与Hap_5都属于单倍型类群T3、只有一个位点的差异（16042/16055），Hap_7与Hap_3都属于单倍型类群T4、只有一个位点的差异（16302），说明它们之间的母系亲缘关系还是比较相近的。Hap_2～Hap_5都是由多个样本所共享，并且这4个单倍型在二里头文化时期和二里岗文化时期都有分布，特别是Hap_2从二里头文化三期到二里岗文化晚期的各个阶段都有分布。

除了在二里头文化四期早段的地层中发现的一例属于T2的样本（ELT1，Hap_8）外，无论是将二里头遗址作为一个整体，亦或是以每个分期作为一个群体进行比较，都可以看出，二里头遗址家养普通牛的主体遗传结构和主要单倍型都没有明显变化，从二里头文化时期到二里岗文化时期，家养普通牛的遗传结构具有母系遗传连续性。

从中介网络图（图二，A、B）中可以看出，二里头遗址的8个单倍型（Hap_1～Hap_8）中，除Hap_4以外，其余单倍型均可以在中国其他古代家养普通牛中找到。并且属于单倍型类群T2的单倍型Hap_8，属于单倍型类群T3的单倍型Hap_1、Hap_2、Hap_5和Hap_6，属于单倍型类群T4的单倍型Hap_3，在中原地区先秦时期其他考古遗址中也都有发现；同样属于单倍型类群T4的单倍型Hap_7虽然在中原地区尚未发现，但是在大山前、石峁、打石沟等遗址中有发现，且Hap_7与Hap_3相比，仅有一个位点的差异（16302）。Hap_4虽然在中国其他遗址中尚未发现，但是它与Hap_2也只有一个位点的差异（16127）。

将二里头遗址黄牛遗传结构特征放到中原地区先秦时期家养黄牛群体中进行比较发现，年代较早的王城岗[40]、陶寺和周家庄[41~42]都是以T3为主，同时存在T3和T4两个单倍型类群的家养普通牛母系遗传结构。到了二里头遗址，其家养普通牛的主体母系遗传结构没有显著变化，只是在二里头文化四期早段的地层中发现了一例属于T2的样本（Hap_8），与其年代相近的花地嘴遗址、望京楼遗址都发现了属于T2的样本。年代略晚的偃师商城[43]、殷墟[44]等遗址也都发现了属于T2的样本，至此逐渐形成了以T3为主，同时存在T2、T3和T4三个单倍型类群的家养普通牛母系遗传结构。就目前研究结果来看，单倍型类群T2应该是在二里头文化时期才进入到中原地区的，并且属于T2的这几个样本，都共享有相同的单倍型（16057C-16185A-16255C），即具有相同的母系来源。综上所述，本文认为二里头家养普通牛在中原地区先秦时期家养普通牛的发展过程中处于承上启下的位置。

锶同位素研究表明，二里头文化二期该遗址先民已开始饲养黄牛，从早至晚大多数都来自当地，但是其消费的黄牛中也有少量可能非本地出生，自始至终都存在外地来源[45~46]。这些少量的非本地出生的黄牛来源于何地并不知晓，也许可以从二里头文化四期早段新出现的单倍型类群T2去探寻。

二里头文化对早期中国具有深刻的影响力，向南可到江汉地区，东至江淮海岱，西至甘肃东部，北达内蒙古中南部和西辽河流域。与龙山文化晚期黄牛的DNA遗传结构相比较，二里头遗址的虽然继承了其主体的遗传结构，但是单倍型类型T2的出现，使其多样性有所提高，其遗传结构也趋复杂化。其主要原因可能是二里头为夏时期都城，对黄牛的需求非常高，能够吸收来自各地的家养黄牛。

另外，望京楼遗址黄牛的锶同位素研究表明，该遗址的牛大部分可能是外来的[47]。DNA研究显示，望京楼遗址和二里头遗址家养普通牛的遗传结构相似，还有多个共享单倍型。这两个遗址年代相近，所处地理位置很近，不排除有二里头向望京楼输出家养普通牛的可能。

目前二里头遗址出土黄牛的DNA研究，主要集中在线粒体DNA控制区母系遗传结构的比较和分析，存在其片面性。随着古DNA技术的逐渐发展与成熟，古DNA研究已经过了线粒体DNA、核DNA短片段研究发展到了古基因组研究水平，进入了稳步发展的实用阶段。中国古代黄牛的基因组研究工作也已经得到开展，但是目前所获得的成果还比较少[48~51]，特别是中原地区古代黄牛的基因组研究还很薄弱[52]。本课题组也对二里头遗址黄牛的DNA进行定量和文库制备实验，遗憾地是DNA初始浓度及文库质检结果不甚理想。鉴于该批材料的重要性，接下来将会尝试性地优化DNA提取方案并有针对性地进行捕获实验，以期能够获得更多的关于二里头遗址黄牛的遗传信息。

四、结论

本研究以二里头遗址出土的黄牛遗存作为研究对象进行线粒体DNA母系遗传分析，得出以下认识。

（1）二里头遗址出土黄牛全部属于家养普通牛，可以归属于线粒体DNA单倍型类群T2、T3和T4，以T3为主，T4次之，T2最少。该遗传结构特征符合中原地区古代黄牛的遗传结构模式；从二里头文化三期至二里岗文化晚期，二里头家养普通牛的遗传结构主体相似，具有母系遗传连续性。

（2）中原地区先秦时期考古遗址出土家养普通牛具有较近的母系亲缘关系。二里头家养普通牛在中原地区先秦时期家养普通牛的发展过程中处于承上启下的位置，单倍型类群T2应该是在二里头文化时期才进入到中原地区的。

附记：本文为国家社科基金项目“二里头与偃师商城遗址出土动物遗存的分析与比较研究”（项目编号21BKG011）、中国社会科学院科技考古与文化遗产保护重点实验室“古DNA技术在考古学研究中的应用”（项目编号S20250405）、国家文物局“考古中国·夏文化研究”（文物保函〔2020〕25号）子课题“夏文化的生业、资源与经济技术”、“河南省四个分时期专题历史文化研究课题”之“夏文化的生业、资源与经济技术”课题、中国社会科学院科技考古与文化遗产保护重点实验室“科技考古与研究重大问题联合攻关项目”子课题“中国古代生业模式与科技考古研究”（项目编号S20250206）、中华文明探源研究“中华文明起源进程中的生业、资源与技术研究”（项目编号2020YFC1521606）的阶段性成果。感谢中国社会科学院考古研究所二里头工作队为本研究提供了宝贵的样本；感谢编辑部老师提出的宝贵意见。

（作者：赵欣、李志鹏、东晓玲、袁靖,中国社会科学院科技考古与文化遗产保护重点实验室、中国社会科学院考古研究所;张桦,西蒙菲莎大学(Simon Fraser University)考古学系古DNA实验室;赵海涛,中国社会科学院考古研究所;毕鹤洋,首都师范大学历史学院。另此处省略注释，完整版请查《江汉考古》2025年第3期）

来源：大明湖畔看今夕