摘要：脑血管疾病，尤其是涉及脑部血管狭窄的病症（如缺血性中风、动脉粥样硬化和烟雾病），因其复杂性和受累区域的关键重要性而构成重大挑战。虽然目前的手术血运重建、血管成形术和支架置入等治疗手段能恢复血流灌注，但这些方法往往难以复现脑血管复杂的解剖结构和动态血流环境，限制

仅供医学专业人士阅读参考

脑血管疾病，尤其是涉及脑部血管狭窄的病症（如缺血性中风、动脉粥样硬化和烟雾病），因其复杂性和受累区域的关键重要性而构成重大挑战。虽然目前的手术血运重建、血管成形术和支架置入等治疗手段能恢复血流灌注，但这些方法往往难以复现脑血管复杂的解剖结构和动态血流环境，限制了治疗效果与生理功能的恢复。因此，迫切需要发展先进技术来构建精确且具备功能性的脑部狭窄血管模型，以促进疾病认知与治疗突破。脑血管狭窄区域与动脉粥样硬化等疾病密切相关，其中剪切力响应的内皮功能对疾病进展至关重要。然而由于体内环境的复杂性，血流诱导炎症的研究仍具挑战性，这凸显了对精密设计的体外模型的需求。

来自韩国浦项科技大学的 Byoung Soo Kim等团队通过3D同轴生物打印技术和机械增强型细胞外基质（ECM）生物墨水，构建了具有生理相关性的狭窄脑血管体外模型，用于探究血流诱导的内皮炎症反应。这种由血管脱细胞ECM、胶原蛋白和海藻酸钠组成的复合生物墨水，其动态模量提升约65倍，可实现可灌注结构的稳定成型。通过打印参数优化，成功制备出管腔直径250-500 µm的精准狭窄血管模型。在3 mL/min入口流速下的计算流体力学模拟预测了狭窄区域的紊流现象。生物打印血管表现出连续的内皮覆盖、连接蛋白（CD31、ZO-1和VE-钙黏蛋白）表达及尺寸依赖性渗透性，证实了成熟血管屏障的形成。在紊流条件下，ICAM-1（约2.2倍）和VCAM-1（约1.5倍）表达上调，验证了血流动力学应力诱导的炎症反应。这些发现凸显了3D生物打印在体外模拟脑血管疾病方面的潜力，为未来治疗创新奠定了基础。相关工作以题为“Embedded 3D-Coaxial Bioprinting of Stenotic Brain Vessels with a Mechanically Enhanced Extracellular Matrix Bioink for Investigating Hemodynamic Force-Induced Endothelial Responses”的文章发表在2025年06月24日的期刊《Advanced Functional Materials》（IF 19，中科院一区）。

本文亮点：

（1）采用动态模量提升65倍的复合生物墨水，结合同轴打印技术，精准构建250-500 µm狭窄脑血管模型，复现生理结构与血流环境。

（2）模型展现连续内皮覆盖及连接蛋白表达，渗透性尺寸依赖，证实成熟血管屏障形成，并成功模拟紊流诱导的炎症标志物上调。

（3）通过计算流体力学与实验结合，揭示狭窄几何-血流紊乱-炎症的关联，为脑血管疾病研究、药物测试及个性化医疗提供创新平台。

【创新型研究内容】

本研究旨在开发一种3D同轴生物打印技术，用于构建具有可控血管几何形态的脑血管模型（图1）。本文假设，通过复现狭窄几何结构可诱导紊流模式，从而促进内皮炎症反应，在体外重现脑血管疾病的关键病理生理特征。为实现这一目标，本文开发了物理增强型血管组织源性细胞外基质（VdECM）生物墨水——通过添加胶原蛋白减少结构收缩，并引入海藻酸钠促进同轴打印过程中的快速交联与结构稳定性。该技术能精确构建狭窄几何形态，用以研究其生物力学及生物学效应。这种复现复杂血管结构及其在血脑屏障内相互作用的能力，对推动脑血管疾病研究和促进靶向治疗策略开发具有重大潜力。该平台还可应用于药物测试与治疗创新，最终为神经系统疾病的认知与治疗提供新途径。

图1 采用3D浴槽式同轴生物打印技术构建狭窄脑血管模型的集成化方案

【血管脱细胞外基质水凝胶的制备】

脱细胞外基质（dECM）是构建功能性组织器官的理想候选材料。通过保留关键ECM成分同时去除免疫原性细胞组分，这种生物活性材料能重现并再生组织微环境。猪主动脉组织因易获取且成本低于其他动物模型，已广泛应用于食品工业。其ECM成分（包括胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖GAGs）与人类组织高度相似，这些成分对维持血管组织完整性和功能至关重要。本研究采用已建立的方案（图2a,b）对猪主动脉进行脱细胞处理制备VdECM水凝胶：将切碎的血管组织在动态搅拌条件下经洗涤剂理化处理，再通过酸性溶液溶解。多步脱细胞后保留了73.64±2.19%的原始组织干重，表明提取效率良好。值得注意的是，VdECM中DNA含量显著降至50 ng/mg以下（17.81±2.25 ng/mg）（图2c-i），说明细胞成分被有效清除，可大幅降低残留猪细胞引发免疫反应的风险。

关键成分分析显示：GAGs（天然组织49.75±0.38 µg/mg，VdECM 48.53±0.54 µg/mg）、胶原蛋白（天然组织79.1±1.8 µg/mg，VdECM 61.7±1.7 µg/mg）和弹性蛋白（天然组织7.4±0.2 µg/mg，VdECM 13.04±0.06 µg/mg）均得到有效保留（图2c-ii–iv），这些成分对促进血管化具有潜在作用。特别发现脱细胞组织的弹性蛋白含量反超天然组织，这可能源于细胞组分去除后弹性蛋白的抗洗涤剂特性使其相对含量升高。组织化学染色定性验证：苏木精-伊红染色显示细胞核指示的细胞成分被成功清除（图2d-i），Masson三色染色和Verhoeff-Van Gieson染色证实VdECM中胶原纤维与弹性纤维完整保留（图2d-ii,iii）。结果表明VdECM不仅保持丰富的生化成分和结构完整性，相较于单一组分材料更能有效模拟组织微环境。

图2 血管组织源性脱细胞细胞外基质（VdECM）水凝胶的开发

【混合VdECM生物墨水的配制】

基于猪血管组织的细胞外基质（ECM）具有异质化生化成分，能为细胞功能提供有利微环境。然而其力学性能的不足会阻碍细胞附着、活性和功能，当细胞施加牵引力时会导致过度收缩。这种不稳定性可能增加细胞压力并诱发凋亡。机械完整性的丧失被推测源于脱细胞过程——高细胞密度组织所需的苛刻条件可能导致胶原等重要ECM成分降解，削弱材料结构稳定性。

为解决该问题，本研究通过将VdECM水凝胶转化为功能性生物墨水实现物理增强。值得注意的是，VdECM的最高浓度确定为2%（w/v），因更高浓度会导致内聚力过强而无法移液。但低于2%（w/v）的水凝胶又因细胞收缩性易发生结构变形（图3a）。为提升机械与结构稳定性，通过添加胶原减少水凝胶收缩、引入海藻酸盐促进快速离子交联和同轴打印结构维持，配制出混合VdECM生物墨水。

实验显示，纯VdECM水凝胶（1V：1%[w/v]；2V：2%[w/v]）出现显著收缩，而添加胶原的VdECM组（1V2C：1%VdECM+2%胶原；1V2C1A：1%VdECM+2%胶原+1%海藻酸盐）保持形状稳定（图3b）。同轴打印的管状结构中，含海藻酸盐的混合生物墨水通过快速交联机制成功形成可灌注3D管状结构，而无海藻酸盐组则发生塌陷（图3c）。

流变测试表明，VdECM基水凝胶具有剪切稀化特性，粘度随剪切速率增加而降低，证实其可注射性（图3d）。复数模量分析显示所有组（除1V外）均存在明确的流动点（储能模量G′与损耗模量G″发生相变），赋予打印可控性（图3e）。该流动点标志着材料在应力下从固态向液态转变的阈值，实现精确丝状沉积。恢复测试验证了混合生物墨水作为浴材料的可行性——在不同剪切速率下能恢复原始模量值，为嵌入式同轴打印中挤出的丝状体提供即时机械支撑（图3f）。

图3 血管组织源性脱细胞基质（VdECM）生物墨水与复合生物墨水的性能对比

【维度控制生成狭窄血管结构】

同轴打印技术通过直接挤出中空管状结构，简化了传统多步骤的血管构建流程，确保了高保真度与分辨率。本研究将优化的混合生物墨水配方应用于浴内同轴3D生物打印技术，通过分析打印参数实现血管结构几何变化的精准复现。重点关注横截面积变化——这一体外动脉粥样硬化严重程度的关键指标。基于"打印平台移动速度决定管状结构尺寸"的假设，实现了管径与壁厚的精确调控（图4a）。最优化的VdECM混合生物墨水与钙离子修饰的PF-127分别输送至浸没在生物墨水浴中的同轴喷嘴核心层与壳层（图4b）。特别选用23-gauge核心/17-gauge壳层的同轴喷嘴，可构建微米级内径血管，精准模拟天然脑血管微环境。气压参数（壳层500 kPa，核心层35 kPa）经预实验确定为维持同轴几何结构、实现连续内皮单层形成的最低稳定挤出压力。当打印速度从400提升至1200 mm/min时，血管内径显著减小（400 mm/min时为1340.0±0.12 µm；800 mm/min时为860.22±0.34 µm；1200 mm/min时为551.30±1.23 µm），有效实现了管腔狭窄的可控建模（图4c-i–ii）。壁厚呈轻微递减趋势（400 mm/min时为13.75±0.23 µm；800 mm/min时为12.53±0.12 µm；1200 mm/min时为11.80±0.34 µm），但始终保持超薄特性以支持内皮单层形成。采用绿色/红色微珠进行的灌注实验证实血管结构无堵塞或断裂（图4c-iii,d）。通过将打印速度临时提升至3600 mm/min，成功构建出局部狭窄血管段（图4e放大图）。狭窄程度可精准调控（支持信息图S5），该技术为动脉粥样硬化建模及其血流动力学研究提供了重要工具。

图4 通过打印参数优化实现狭窄血管结构的精准成型

【浴内三维同轴生物打印构建脑部血管网络】

为研究脑血管生理及病理机制，必须精准复现血管内表面连续的内皮层结构。内皮细胞屏障的核心功能是选择性通透性——通过调控细胞旁路膜通道限制液体及溶质渗透。这种屏障功能对维持血管稳态至关重要，也是工程化模型需要复现的关键特性。鉴于大脑执行维系生命的重要功能，其内皮屏障具有高度特异性，堪称人体内的"保护性圣所"。因此，复制这种高选择性限制性内皮结构对评估本技术的适用性至关重要。

本文将载有脑血管内皮细胞的血管结构生物打印至专为多功能内皮培养系统设计的培养平台（图5a）。内皮细胞培养基通过针锚定孔从培养基腔室直接输送至血管壁，实现与血管通道的无缝衔接（图5b）。培养7天后，血管结构中的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人脑微血管内皮细胞（HBMECs）呈现形态变化、细胞伸长并形成连续单层内皮（图5c）。活死细胞检测显示细胞存活率保持97%以上（活细胞：97.13±8.28%；死细胞：2.86±8.18%）（图5d）。虽然构建体在14天内仍保持较高细胞间完整性，但死细胞数量及细胞间隙显著增加。

通过连接标志物（CD31、ZO-1和VE-钙粘蛋白）的表达证实了内皮功能化，表明成熟功能性内皮屏障的形成（图5e-g）。采用异硫氰酸荧光素标记葡聚糖（70 kDa）进行的扩散渗透性测试显示，HBMECs组屏障功能最优（裸支架组10.75±0.84 µm/min；HUVECs组4.55±1.08 µm/min；HBMECs组3.93±0.13 µm/min）（图5h）。不同分子量葡聚糖（70/3 kDa）和小分子（0.3 kDa钠盐）的测试进一步揭示尺寸依赖性渗透规律（图5i）。这些发现证明该平台能支持多样化内皮培养，并为研究脑部血管内皮屏障功能提供有效工具。

图5功能性脑血管的3D同轴生物打印制备

【血流动力学响应】

脑血管的剪切力响应特性对维持脑循环功能至关重要，并与疾病进展密切相关。然而由于血管环境的复杂性和循环系统的动态相互作用，对这些特性进行深入参数化研究存在技术挑战。这些局限凸显了对精密工程模型的需求——该模型需能精确控制实验条件，从而系统研究血管结构、血流动力学与炎症反应间的关联。

为应对这些挑战，近年来整合体外与计算机建模技术的多维度研究方法备受关注，有助于开发具有更高生理相关性的疾病模型。作为典型案例，本研究采用成熟技术复现了动脉粥样硬化的病理损伤特征。严重动脉粥样硬化的典型表现为血管狭窄超过75%，因此本文构建了直径缩减一半的狭窄血管模型以模拟疾病进展。

研究首先聚焦狭窄区域血流的生物力学特性及其病理效应：通过计算流体力学模拟分析血管模型中的关键血流动力学参数（如壁面剪切应力和流速），并开发了狭窄脑血管芯片模型（图6a）。利用已建立的3D生物打印技术，成功制备出能复现生理相关脑血管条件的狭窄模型（图6b,c）。计算分析预测了血管几何形态对流体动力学的影响，证明狭窄结构会固有地诱发以低剪切应力和血流回流为特征的紊流模式（图6d）。荧光微球可视化实验观测到狭窄病变处与预测相符的血流动力学改变（图6e）。

当持续给予异常血流刺激时，脑血管模型中炎症标志物表达显著上调：ICAM-1（直血管8.33±0.62 ng/mL；狭窄血管18.07±1.02 ng/mL）与VCAM-1（直血管0.97±0.26 ng/mL；狭窄血管1.48±0.40 ng/mL）（图6f,g）。这些发现证实，工程化狭窄脑血管模型提供了生理相关的微环境，使脑内皮细胞展现出剪切力响应行为，凸显了该模型在体外研究脑血管病理机制中的应用潜力。

图6 生物打印狭窄脑血管的血流动力学响应特征

【总结与展望】

本研究成功开发了混合血管组织源性ECM生物墨水，并应用于浴内三维同轴生物打印技术，实现了脑部狭窄血管的精准构建。通过优化生物墨水成分与打印参数，实现了血管病理学几何形貌的精确复现。所构建的血管不仅具备内皮屏障功能，还表现出血流动力学响应特性，证实其作为脑血管疾病模型的潜力。计算模拟与实验分析共同验证了狭窄几何形态、血流紊乱与炎症反应之间的关联机制。该技术在脑血管疾病机理研究、药物测试及个性化医疗应用领域展现出重要价值。

来源：EngineeringForLife一点号