摘要：● 本研究使用宏基因组数据，提议了未培养的细菌新门类朱雀菌门，结合比较基因组学，深入解析该类群不同谱系的功能差异，揭示了其混合营养生活方式，并重构了该类群关键功能基因的进化历史，拓展了对该类群的认知。

宏基因组分析揭示朱雀菌门的混合营养生活方式

iMeta主页：http://www.imeta.science

研究论文

● 原文: iMeta (IF 23.8)

●

原文链接DOI: https://doi.org/10.1002/imt2.249

● 2024年11月23日，中山大学李文均、刘兰和焦建宇等在iMeta在线发表了题为“

Metagenomic analysis sheds light on the mixotrophic lifestyle of bacterial phylum Zhuqueibacterota

● 本研究使用宏基因组数据，提议了未培养的细菌新门类朱雀菌门，结合比较基因组学，深入解析该类群不同谱系的功能差异，揭示了其混合营养生活方式，并重构了该类群关键功能基因的进化历史，拓展了对该类群的认知。

● 第一作者：连政汉

● 通讯作者：李文均（liwenjun3@mail.sysu.edu.cn）、焦建宇（jiaojy5@mail.sysu.edu.cn）、刘兰（liulan9@mail.sysu.edu.cn）

● 合作作者：Nimaichand Salam、谭莎、袁洋、李蒙蒙、李昱娴、刘泽涛、胡超建、吕爱萍、欧阳玉婷、卢彩玉、张靖宜、陈瑛、陈乐滨、罗振豪、马斌、花正双

● 主要单位：中山大学生命科学学院、中国科学技术大学环境科学与工程系、浙江大学环境与资源学院、中国科学院新疆生态与地理研究所

亮 点

● 基于热泉宏基因组和公共MAGs，提出了一个新的细菌门——朱雀菌门（Zhuqueibacterota），它被归类在Fibrobacterota-Chlorobiota-Bacteroidota（FCB）超门中，包括一个纲和五个目；

● 朱雀菌门在全球范围内分布，大多数成员是兼性厌氧菌；其中朱雀菌目（Zhuqueibacterales）利用氢气作为电子供体，通过Calvin-Benson-Bassham（CBB）循环进行碳固定；

● 系统发育和代谢分析揭示了朱雀菌门在热泉碳循环中的关键作用，以及在其进化过程中频繁发生的水平基因转移事件。

摘 要

本研究分析了来自腾冲热泉的30个新的宏基因组组装基因组（MAGs）和45个公开的MAGs。基于基因组和16S rRNA基因的系统发育分析表明，它们在Fibrobacterota-Chlorobiota-Bacteroidota（FCB）超门中形成了一个单独发育谱系，因此本研究提议将它们分类为一个新的门，即朱雀菌门（Zhuqueibacterota），其中包含一个纲和五个目。朱雀菌门的成员在全球范围内广泛分布，可能是兼性厌氧菌，且朱雀菌目（Zhuqueibacterales）能够以氢气作为电子供体，耦合Calvin-Benson-Bassham（CBB）循环进行化能自养。群落水平的代谢预测表明，朱雀菌门在热泉的碳固定中扮演着重要角色。祖先状态重建分析表明朱雀菌门在进化过程中发生了频繁的水平基因转移（HGT）事件。兼性厌氧特征似乎是其祖先特征，部分谱系在失去氢氧化能力的同时，通过HGT事件获得了碳固定能力。这些结果揭示了朱雀菌门的多样性、生态角色和进化历史，强调了其在碳循环中的重要作用。

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全文解读

引 言

地球孕育了丰富的真核和原核生物。然而，在实验室条件下可培养的细菌仅占少数，大多数细菌门都没有获得纯培养菌株。候选细菌门KSB1是一个典型的未培养的细菌门，最初在富含硫的海洋沉积物中被发现，现在已确认其具有广泛的生态适应性。在河口沉积物中，基因组揭示了其具有碳水化合物代谢和脂肪酸β-氧化的能力。在热液沉积物中，KSB1成员的基因组中拥有编码苯基琥珀酸合酶和烷基琥珀酸合酶的基因，表明其在厌氧烃降解中的潜在作用。此外，KSB1的MAGs在湿地沉积物中被发现，其编码了异丙醇脱氢酶、磷酸转移丁酰酶和丁酸激酶等功能基因，进一步凸显了其生态功能多样性。值得注意的是，KSB1的MAGs也从热泉的宏基因组数据中被重建，表明KSB1可能拥有新的功能生态位，暗示其具备能在极端环境中生存的独特生态适应性。尽管从多种环境中重建了近百个KSB1的（MAGs），但高质量基因组的匮乏限制了我们对KSB1生态角色和代谢潜力的深入理解。因此，需要更全面的研究来探讨其代谢途径和进化历史。

为此，本研究不仅从公共数据库收集了可用的KSB1基因组，还从热泉样本中分箱获得了新的MAGs，显著扩展了KSB1的基因组多样性，厘清了系统发育关系，并揭示了其兼性厌氧的生活方式及通过Calvin-Benson-Bassham（CBB）循环进行碳固定的潜力。基于这些发现，本研究将这个细菌门正式命名为朱雀菌门（Zhuqueibacterota）。

结果与讨论

候选细菌新门——朱雀菌门的发现

本研究从16个热泉的宏基因组数据中重构了30个KSB1高质量的MAGs，并从GenBank下载了45个高质量的KSB1基因组，共获得75个高质量MAGs用于后续分析。基于基因组分类数据库（Genome Taxonomy Database，GTDB）的120个细菌特有的标记基因构建最大似然树，结果显示KSB1在Fibrobacterota-Chlorobiota-Bacteroidota（FCB）超门内形成一个单系群，并且与其它细菌门显著分离。此外，基于16S rRNA基因的系统发育树进一步支持了KSB1作为Psuedomonadati界下的一个独立细菌门的分类地位。

为了进一步厘清朱雀菌门内的系统发育关系，我们使用120个细菌特有的单拷贝标记基因构建了最大似然树。虽然过往研究将KSB1划分了四个进化分支，但我们的系统发育分析揭示了五个不同的群组，分别对应于GTDB r214数据库中未描述的KSB1门的五个目（图1A）。同时，本研究确认了第二分支（GTDB分类：p__JdFR-76）并非KSB1的一部分，而是一个临近的独立门类。基于平均氨基酸一致性（AAI，同种95%–100%）和平均核苷酸一致性（ANI，同种95%–100%），本研究对新谱系进行了物种层面的分类，这与GTDB的分类一致。此外，基于系统基因组树和GTDB工具包（GTDB-Tk）的分析，本研究对属级和更高分类等级的新谱系进行进一步分类。从75个MAGs中鉴定出1个纲，5个目，14个科，27个属和40个种，其中包括本团队的30个MAGs中的9个新种。遵循使用MAGs作为未培养细菌的物种和更高分类等级的定义的建议，本研究正式将KSB1命名为朱雀菌门（Zhuqueibacterota phyl. nov.），该门类群包括了Zhuqueibacterales（O1）、Residuimicrobiales（O2）、Oleimicrobiales（O3）、Thermofontimicrobiales（O4）和Oceanimicrobiales（O5）这5个目。

朱雀菌门的全球分布

通过在IMNGS平台提交16S rRNA基因序列查询SRA数据库，本研究显示朱雀菌门在全球范围内广泛分布，且存在于多种生境中，这些生境包括水体、沉积物、土壤、热液喷口以及与动植物相关的生态系统（图1B）。在土壤和生物膜样本中，朱雀菌门表现出较高的相对丰度，在生物膜中的相对丰度为3%到10%，暗示生物膜可能为这些细菌提供了一个保护性的生态位。在该门的五个目中，Zhuqueibacterales（O1）作为该门类中最广布的目，在多种不同的环境中均有发现（图1C）。Residuimicrobiales（O2）和Oleimicrobiales（O3）主要在热液喷口和沉积物中被检测到，而Thermofontimicrobiales（O4）则在海洋环境中更为丰富。尽管由于Oceanimicrobiales（O5）缺乏16S rRNA基因序列数据，其具体分布尚无法确定，但朱雀菌门在多种生态环境中的广泛分布（图1C）仍然充分展示了其对不同生境的适应能力，凸显了其在生态学上的重要地位。

朱雀菌门的兼性厌氧特性

以往研究显示，朱雀菌门在缺氧环境中相对丰富，这表明其可能具有厌氧的生活方式。本研究发现朱雀菌门的所有谱系中都含有与厌氧代谢相关的关键基因，包括乙酰辅酶A合酶（acs）、磷酸乙酰转移酶（pta）、醋酸激酶（ack）、乙醛脱氢酶（aldh）和乙醇脱氢酶（adh）基因，这些基因的存在表明它们可能通过发酵过程产生乙醇等。此外，本研究发现Residuimicrobiales（O2）、Oleimicrobiales（O3）和Thermofontimicrobiales（O4）中广泛存在Rnf复合体。对rnfABCDEG基因簇的系统发育分析显示，它们与厌氧微生物聚为同一进化支系，进一步支持了这些目可能具有厌氧生活方式的假设。

特别值得注意的是，朱雀菌门微生物基因组普遍含有编码细胞色素bd泛醌氧化酶的cydAB基因，这使得其能在低氧条件下通过呼吸链利用氧气。同时，coxABC基因在Zhuqueibacterales（O1）和Oceanimicrobiales（O5）的所有MAGs中均有检测，同时在部分Residuimicrobiales（O2）和Thermofontimicrobiales（O4）的MAGs中也有发现。此外，Zhuqueibacterales（O1）和Oceanimicrobiales（O5）的部分MAGs还编码了需氧的aa3型细胞色素c氧化酶。完整的氧化磷酸化途径基因主要分布在Zhuqueibacterales（O1）和Oceanimicrobiales（O5），表明Zhuqueibacterales（O1）和Oceanimicrobiales（O5）的成员可能具备利用氧气作为最终电子受体的能力。

综合分析表明，Zhuqueibacterales（O1）和Oceanimicrobiales（O5）的成员更可能是兼性厌氧菌，而非专性厌氧菌。

图1. 朱雀菌门的系统发育定位、全球分布和代谢重建

（A）基于120个标记基因串联比对的最大似然树。内部节点的自举值≥80以实心黑圆圈表示。分支颜色对应于目级分类学分类。（B）朱雀菌门各目在不同分离环境中的相对丰度。红色代表Zhuqueibacterales（O1），黄色代表Residuimicrobiales（O2），蓝色代表Oleimicrobiales（O3），绿色代表Thermofontimicrobiales（O4）。（C）显示检测到朱雀菌门的生物样本的地理分布图。由于Oceanimicrobiales（O5）的宏基因组组装基因组（MAGs）中缺乏16S rRNA基因序列，未评估其分布。（D）朱雀菌门代谢潜力的概览。实心圆圈代表在≥50%的MAGs中存在的基因或代谢途径，半实心圆圈表示在

热泉中朱雀菌门的混合营养生活方式与生态角色

通过代谢途径重建，发现所有朱雀菌门的五个目都含有完整的糖酵解、糖异生和戊糖磷酸途径（图1D）。被归类为Zhuqueibacterales（O1）、Thermofontimicrobiales（O4）和Oceanimicrobiales（O5）的MAGs中都编码完整的三羧酸（TCA）循环基因。此外，在这75个MAGs中鉴定出多种碳水化合物活性酶（CAZymes），包括79种糖苷水解酶（GHs）、10种糖基转移酶（GTs）、10种碳水化合物酯酶（CEs）、8种多糖裂解酶（PLs）和10种碳水化合物结合模块（CBMs）。有趣的是，在35个Zhuqueibacterales的MAGs中鉴定出了编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶（RuBisCO）大亚基的基因，其系统发育分析表明这些rbcL基因属于I型（图2A），在CBB循环的碳固定功能中起着关键作用。此外，在rbcL基因的上下游发现了编码RuBisCO小亚基（rbcS）、磷酸核糖激酶（PRK）、转酮酶（TKT）、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（FBPA）、果糖-1,6-二磷酸酶（FBPase）和5-磷酸-核酮糖3-差向异构酶（RuPE）的基因。基于此，本研究推测朱雀菌门的成员具有通过CBB循环进行碳固定的能力。此外，景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶（SBPase）的缺失和转醛醇酶（TAL）的存在表明朱雀菌门可能使用转醛醇酶变体的CBB循环进行碳固定。

使用METABOLIC v4.0，我们构建了一个包含186个中/高质量MAGs（完整性>50%，污染度

朱雀菌门的进化历史

为了探讨朱雀菌门的进化历史，本研究预测了基因获得和丢失事件，并将其映射到贝叶斯树上。结果显示，朱雀菌门基因组随着时间积累了更多的基因家族（图2D）。其中，71%的水平基因转移（HGT）事件发生在Zhuqueibacterales（O1）中，主要来自与热泉相关的MAGs。尽管热泉环境中普遍存在基因组缩减的趋势，HGT在增加基因组多样性中发挥了重要作用。分析表明，朱雀菌门的祖先可能已经编码氢化酶基因，但随后的基因丢失事件导致部分谱系失去了利用氢气的能力。此外，抵御高氧胁迫的cydAB基因（图2E，表S9）在进化早期被获得，而coxABC基因则通过独立事件在不同谱系分别获得（图2E）。与厌氧发酵相关的基因在多个进化节点上发生丢失，这可能促进了代谢多样化，进一步支持朱雀菌门祖先是兼性厌氧细菌的推测。与CBB循环相关的基因（如rbcL、rbcS和PRK）是通过逐步获得的方式积累的。这表明，随着时间推移，生活在热环境的朱雀菌门细菌逐步具备了通过CBB循环进行固碳的能力。

图2. 关键基因鉴定与进化历史重建

（A）rbcL基因的系统发育树，内部节点显示自举值≥80以实心黑星标示。分支颜色代表不同的rbcL基因型。（B）与Calvin-Benson-Bassham（CBB）循环相关的基因簇组织。（C）氢化酶基因簇的组织结构。（D）使用COUNT软件基于MyBayes的贝叶斯树进行的祖先基因组内容重建。内部节点旁边的直方图表示基因获得（蓝色）和丢失（粉色）事件。（E）推断的与CBB循环、氢化酶和末端氧化酶相关的朱雀菌门中的基因获得和丢失事件。

结 论

在本研究中，我们利用高质量的基因组数据深入解析了未培养细菌门KSB1（朱雀菌门）的多样性和功能，显著扩展了我们对该类群的认识。本研究揭示了朱雀菌门显著的功能分化，以及不同谱系对独特环境条件的适应偏好。尤为引人注目的是，Zhuqueibacterales微生物表现出兼性厌氧的化能自养特性，在维持热泉微生物群落的平衡中发挥了重要作用。通过祖先状态重建，推测朱雀菌门的祖先可能已经具备了兼性厌氧的生活方式，而其碳固定能力很可能是通过水平基因转移（HGT）获得的。本研究不仅为理解朱雀菌门的生态功能提供了新的视角，也为未来的研究指明了方向。此外，本研究表明利用氢气氧化自养富集体系，可能成为分离和纯化该类群成员的一种有效方法。

代码和数据可用性

本研究中讨论的MAGs已存储于GenBank数据库，项目编号为PRJNA895542（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA895542/）。每个MAG的登录号详细列于附表S1中。所使用的数据和脚本已保存在GitHub上，可通过链接https://github.com/lianzhh-pub/Code_for_iMeta2024访问。补充材料（包括图表、数据表、脚本、图形摘要、幻灯片、视频、中文翻译版本及更新材料）可以在在线DOI或iMeta科学网站http://www.imeta.science/获取。

引文格式：

Lian, Zheng-Han, Nimaichand Salam, Sha Tan, Yang Yuan, Meng-Meng Li, Yu-Xian Li, Ze-Tao Liu, et al. 2024. “Metagenomic analysis sheds light on the mixotrophic lifestyle of bacterial phylum Zhuqueibacterota.” iMeta3: e249. https://doi.org/ 10.1002/imt2.249.

作者简介

连政汉（第一作者）

● 中山大学生命科学学院，博士研究生。

● 研究方向为热泉微生物资源与生态，以第一作者（含并列）在iMeta、mLife等期刊发表SCI论文9篇。

刘兰（通讯作者）

● 中山大学生命科学学院，博士后，助理研究员。

● 研究方向为热泉生境厌氧微生物资源的挖掘，生态功能及其进化历史。现已在iMeta、National Science Review、The ISME Journal、Molecular Biology and Evolution、Journal of Hazardous Materials、Frontiers in Microbiology、Systematic and Applied Microbiology和Microbial Ecology等期刊发表SCI论文89篇，其中以第一作者（含并列第一作者）或者通讯作者（含共同通讯作者）发表的SCI论文23篇；谷歌学术总引用1400余次，H指数为18，i10指数为51；主持或参与国家级项目3项；参编专著3部；现担任International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology和Antonie van Leeuwenhoek期刊的审稿人，Frontiers in Microbiology的评审编辑以及《微生物学杂志》审稿人。

焦建宇（通讯作者）

● 中山大学生命科学学院，特聘副研究员。

● 主要研究方向为微生物资源与生态，长期从事热泉等极端环境微生物资源、生态功能与适应性进化等相关领域的研究工作。在宏基因组、宏转录组和培养组等多组学技术，以及微生物菌株定向分离等方面具有丰富的研究经验。目前以第一（含并列第一）或通讯作者（含共通通讯）在iMeta、National Science Review、The ISME Journal、Microbiome、mLife、Environmental Microbiome、Microbiological Research等期刊发表论文二十余篇，以其他作者身份参与发表学术论文六十余篇，谷歌学术总引用1700多次，H指数为18，i10指数为43；参与建立并发表原核生物新门2个、新纲5个、新物种80余个；主持或参与国家级项目7项；主编或参编专著3部；参与撰写新版《伯杰氏古菌和细菌系统学手册》3节。现为iMeta杂志青年编委兼执行副主编，ISME ECS成员，BMC Microbiology编委，Frontiers in Microbiology客座副主编和审稿编辑。

李文均（通讯作者）

● 中山大学生命科学学院百人计划/珠江学者、逸仙学者特聘教授，中国科学院新疆生态与地理研究所兼职特聘研究员（百人计划B类），博士生导师。

● 长期从事高温、高盐碱、海洋等极端或特殊生境（动物肠道、植物内生、洞穴）微生物分类及系统学、生态学研究。现任国际原核微生物系统学委员会（International Committee on Systematics of Prokaryotes，ICSP）国际委员，伯杰氏国际系统微生物学会（BISMiS）现任主席。同时兼任中国微生物学会微生物教学工作委员会副主任委员、国际交流工作委员会委员、普通微生物专业委员会委员、地质微生物专业委员会委员、微生物资源专业委员会委员。Microbiome、Environmental Microbiome、Frontiers in Microbiology、International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology、Antonie van Leeuwenhoek、Archives of Microbiology、BioMed Research International和微生物学报等杂志副主编或编辑，mLife、Syst Appl Microbiol、Journal of Arid Land和微生物学杂志等期刊编委及多个国内外期刊或基金会的通讯评审专家。先后承担并顺利完成了包括国家科技部“973”子课题、重点研发课题、国际合作专项、国家科技基础性工作专项，以及国家自然科学基金（青年、面上、重点、国际合作共10项）等在内的40余项国家级或省级课题的研究。以第一或通讯作者已在iMeta、Natl Sci Rev、Nat Commun、Microbiome、ISME J、Sci Total Environ、Environ Pollut、NPJ Biofilms Microbiomes、Chemosphere、mSystems、Org Lett、Environ Microbiol、Bioresource Technol、Genome Biol Evol、Mol Phylogenet Evol、Front Microbiol、Appl Environ Microbiol、Syst Appl Microbiol、Extremophiles、Int J Syst Evol Microbiol、ANTO等刊物上发表学术论文500余篇，参与发表Nature、Nature Microbiol、Nat Commun、ISME J及其它期刊论文近400余篇，主编或参编专著10余部，受邀撰写新版《伯杰氏系统细菌学手册》20余章，专利40余件。先后建议并命名、发表包括细菌、古菌4个新门，8个新纲，24个目，40余个新科，105个新属，超620余新种。2014-2024连续十余年均入选由世界著名出版公司爱思唯尔（Elsevier）发布的中国高被引学者榜单。

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“iMeta” 是由威立、宏科学和本领域数千名华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等前沿交叉学科。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括中英双语图文、双语视频、可重复分析、图片打磨、60万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊！相继被Google Scholar、PubMed、SCIE、ESI、DOAJ、Scopus等数据库收录！2024年6月获得首个影响因子23.8，位列全球SCI期刊前千分之五(107/21848)，微生物学科2/161，仅低于Nature Reviews，学科研究类期刊全球第一，中国大陆11/514！

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来源：微生物组